施克青，楊 斌，王 楠，楊福偉，秦治剛，張金男*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)外科,吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林省膠質(zhì)瘤精準(zhǔn)診療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GMB)屬于膠質(zhì)瘤中惡性程度最高的類型，臨床上通常以手術(shù)切除為主，輔以放、化療等綜合治療，但患者的預(yù)后較差，死亡率較高。因此，探索治療GMB的有效方法是當(dāng)前醫(yī)療工作者的研究重點(diǎn)[1]。有研究發(fā)現(xiàn)[2-3]，MGMT(O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶)基因啟動(dòng)子甲基化的患者對(duì)烷化劑藥物反應(yīng)較好,預(yù)后優(yōu)于非甲基化的患者，且DNA異常甲基化還可作為預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等分子標(biāo)記物對(duì)腫瘤患者的預(yù)后效果進(jìn)行評(píng)估。MGMT作為一種DNA修復(fù)酶，可逆轉(zhuǎn)由烷化劑引起的DNA損傷，從而導(dǎo)致腫瘤對(duì)替莫唑胺和基于亞硝基脲的化療不敏感。MGMT啟動(dòng)子的甲基化使MGMT沉默，使得腫瘤對(duì)用烷化劑治療更敏感[4]。本文通過對(duì)1例多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者M(jìn)GMT基因啟動(dòng)子甲基化進(jìn)行檢測(cè)與分析，以期為GMB的預(yù)后評(píng)估提供一定的理論依據(jù)。

1 臨床資料

患者，男性，58歲，經(jīng)臨床診斷和影像學(xué)特征確診為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤多出血伴囊性變WHO:IV級(jí)，收集其家人相關(guān)信息。采用MGMT啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)MGMT啟動(dòng)子區(qū)12個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化程度，預(yù)測(cè)替莫唑胺(TMZ)的敏感性?；颊逜片免疫組化：Vinentin(+)；CK(-)；EMA(局部弱+)；GFAP(+)；CD34(血管+)；PR(-)；Ki67(局部30%+)；S-100(+)；011g-2(+)；TDH1(-)；MGMT(3%+)；ATRX(散在+)；P53(局灶10%+)；NeuN(-)。

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)基因變異

變異分級(jí)為Ⅰ類的基因變異的分別為ATRXNM_000489.4intron13 c.4214+3A>G、BRAFNM_004333.4 exon15p.V600E c.1799T>A、CDKN2A缺失、CDKN2B缺失，突變豐度/拷貝數(shù)分別為62.84%、30.39%、0.69、0.63，見表1。

表1 相關(guān)基因變異

2.2 常見分型及預(yù)后基因列表

檢查結(jié)果為野生型中檢測(cè)的項(xiàng)目分別為IDH1、IDH2、TERT、H3F3A/HIST1H3B/HIST1H3C，檢測(cè)內(nèi)容分別為R132、R172、c.-124C>T(C228T)/c.-146C>T(C250T)、p.K28M(K27M)，相關(guān)癌種分別為膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)瘤/腦膜瘤、彌漫中線膠質(zhì)瘤；檢查結(jié)果為未檢出融合的項(xiàng)目分別為BRAF、RELA、YAP1、MYB，檢測(cè)內(nèi)容均為融合，相關(guān)癌種分別為膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、室管膜瘤、血管中心性膠質(zhì)瘤；檢查結(jié)果為未檢出突變>G項(xiàng)目別為ATRX，檢測(cè)內(nèi)容為點(diǎn)突變，相關(guān)癌種為膠質(zhì)瘤；檢查結(jié)果為未檢出擴(kuò)增的項(xiàng)目為EGFR、7號(hào)染色體，檢測(cè)內(nèi)容均為擴(kuò)增，相關(guān)癌種為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；檢查結(jié)果為檢出缺失的項(xiàng)目分別CDKN2A、CDKN2B、1p染色體、19q染色體、10號(hào)染色體，檢測(cè)內(nèi)容均為缺失，相關(guān)癌種分別為膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)瘤、少突膠質(zhì)瘤、少突膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，見表2。

2.3 靶向用藥提示

變異分級(jí)為Ⅰ類，基因變異為BRAFNM_004333.4exon15p.V600E c.1799T>A，突變豐度/拷貝數(shù)約為30.39%，本癌種可能敏感藥物為達(dá)拉非尼+曲美替尼(A級(jí))、維莫非尼+Cobimetinib(A級(jí))、Encorafenib+Binimetinib(C級(jí))、Selumetinib(C級(jí))、達(dá)拉非尼(C級(jí))、維莫非尼(C級(jí))、Ulixertinib(D級(jí))、依維莫司+PLX4720(E級(jí))、依維莫司+Selumetinib(E級(jí))；其他癌種可能敏感藥物為Encorafenib+Binimetinib(C級(jí))、Panitumumab+Encorafenib(C級(jí))、達(dá)拉非尼(C級(jí))、達(dá)拉非尼+曲美替尼(C級(jí))、曲美替尼(C級(jí))、維莫非尼(C級(jí))、維莫非尼+Cobimetinib(C級(jí))、西妥昔單抗+Encorafenib(C級(jí))，無可能耐藥藥物；變異分級(jí)為Ⅱ類，基因變異為CDKN2A缺失，突變豐度/拷貝數(shù)約為0.69，本癌種可能敏感藥物為哌柏西利(E級(jí))，其他癌種無敏感藥物和耐藥藥物，見表3。

表2 常見分型及預(yù)后基因列表

表3 靶向用藥提示

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤中膠質(zhì)瘤約為70%左右，其中，GBM患者占比約50%，是一種最為常見的惡性腫瘤類型，且對(duì)患者身體危害大，預(yù)后效果較差，致死率較高，嚴(yán)重威脅其生活質(zhì)量和生命安全[5]。隨著醫(yī)療水平的提高，GBM治療手段已得到明顯的提升，但患者的中位生存期仍較短，因此，對(duì)GBM病因以及預(yù)后因素的影響具有重要意義[6]。MGMT(O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶)作為一種DNA修復(fù)酶，可提高逆轉(zhuǎn)由烷化劑引起的DNA損傷，降低腫瘤對(duì)替莫唑胺和亞硝基脲的敏感性，而GMT啟動(dòng)子的甲基化可以使MGMT沉默，增強(qiáng)腫瘤對(duì)烷化劑的敏感性[7]，有研究發(fā)現(xiàn)[8]，在GBM患者治療中，約30%-60%的患者M(jìn)GMT啟動(dòng)子是甲基化狀態(tài)，這也說明MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)治療前的預(yù)測(cè)對(duì)患者預(yù)后效果的影響較大。

本例研究發(fā)現(xiàn)，在變異分級(jí)為I類中，基因變異為ATRXNM_000489.4intron13c.4214+3A>G，突變豐度/拷貝數(shù)為62.84%，說明ATRX突變有助于膠質(zhì)瘤的診斷(NCCN.org)。ATRX突變常伴有IDH突變檢出，而幾乎不會(huì)與1p19q染色體缺失同時(shí)檢出。因此，ATRX突變結(jié)合IDH突變是一種典型的星型細(xì)胞瘤?；蜃儺悶锽RAFNM_004333.4exon15p.V600Ec.1799T>A，突變豐度/拷貝數(shù)為30.39%，說明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，BRAFV600E突變主要發(fā)生在幕上毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤，多形性黃色星形細(xì)胞瘤，胚胎發(fā)育不良性神經(jīng)上皮腫瘤,約50%的IDH野生型上皮樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤也存在該變異?；蜃儺悶镃DKN2A缺失，突變豐度/拷貝數(shù)為0.69，提示CDKN2A缺失常與EGFR擴(kuò)增/TERT啟動(dòng)子突變/7，10號(hào)染色體變異同時(shí)出現(xiàn)，是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一類標(biāo)志物，研究表明CDKN2A/CDKN2B缺失與IDH突變型低級(jí)別星形膠質(zhì)瘤/膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或IDH野生型的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后不良相關(guān)(PMID:33235995、32385699)?；蜃儺悶镃DKN2B缺失，突變豐度/拷貝數(shù)為0.63，提示CDKN2B缺失常與EGFR擴(kuò)增/TERT啟動(dòng)子突變/7，10號(hào)染色體變異同時(shí)出現(xiàn)，是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一類標(biāo)志物，研究表明CDKN2A/CDKN2B缺失與IDH突變型低級(jí)別星形膠質(zhì)瘤/膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或IDH野生型的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后不良相關(guān)(PMID:33235995、32385699)[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，突變形式為exon15c.1799T>A p.V600E突變豐度為30.39%，原因在于BRAF作為一種癌基因，位于7號(hào)染色體，它編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，是Ras/Raf/Mek/Erk/Mapk通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件，如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等。研究表明，在多種生類惡性腫瘤中，如惡性黑色素瘤、結(jié)直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的BRAF基因突變[10]。BRAF突變?cè)诤谏亓鲋械陌l(fā)生率約為37%-50%，最為常見的是V600錯(cuò)義突變，大約80%-90%的V600 BRAF突變?yōu)閂600E。通常情況下，BRAF突變不會(huì)與黑色素瘤中的其他致癌基因突變(NRAS突變/KIT突變)同時(shí)發(fā)生。另外，BRAF突變?cè)贜SCLC中發(fā)生率為1%-4%，其中V600E占50%，突變患者多為腺癌和有吸煙史患者。大多數(shù)情況下，BRAF突變不會(huì)與NSCLC中其他致癌基因突變(如EGFR/ALK)同時(shí)發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，突變形式為拷貝數(shù)0.69時(shí)，CDKN2A位于9號(hào)染色體上，可編碼腫瘤抑制蛋白p16、p14arf等幾種蛋白產(chǎn)物。p16基因是1994年美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室Kamb等發(fā)現(xiàn)的新抗癌基因，p16能與cyclinD競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CDK4/6，抑制CDK4/6的激酶活性，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期和DNA合成啟動(dòng)，通過抑制CDK4/6激酶的活性而使pRb不能磷酸化，未磷酸化的pRb增多抑制細(xì)胞增殖。同時(shí)高磷酸化的pRb可誘導(dǎo)p16的表達(dá)與CDK4/6結(jié)合抑制CDK4/6的活性，最終使pRb的磷酸化程度減弱[11]。因而p16在cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F細(xì)胞周期調(diào)節(jié)途徑中起著負(fù)反饋的作用。p16基因的變異或其蛋白的失活都會(huì)導(dǎo)致cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F調(diào)節(jié)途徑的失控使細(xì)胞過度增殖而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。p14arf能夠激活抑癌基因p53。認(rèn)為p16是比p53更重要的一種新型抗癌基因。P16基因已經(jīng)在肺癌、乳腺癌、腦腫瘤、骨腫瘤、皮膚癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌和淋巴瘤、黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)純合子缺失以及無義，錯(cuò)義及移碼突變。這表明p16基因以缺失，突變方式廣泛參予腫瘤形成，檢測(cè)p16基因有無改變對(duì)判斷患者腫瘤的易感性以及預(yù)測(cè)腫瘤的預(yù)后，具有十分重要的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)，MLH1(Exon1-3)-FLNB(Exon12-47)突變豐度34.8%時(shí)，MLH1基因位于3號(hào)染色體，編碼的蛋白參與DNA錯(cuò)配修復(fù)，該基因是遺傳性非息肉性結(jié)腸癌(HNPCC)相關(guān)基因。其突變機(jī)制為DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白的功能缺陷，導(dǎo)致了染色體和微衛(wèi)星不穩(wěn)定，其中微衛(wèi)星不穩(wěn)定是引起HNPCC的主要原因，約90%的HNPCC有MLH1和MSH2基因的胚系突變[12]。

綜上所述，MGMT啟動(dòng)子甲基化與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生存獲益相關(guān)，并用于臨床試驗(yàn)的風(fēng)險(xiǎn)分層。MGMT啟動(dòng)子發(fā)生甲基化的患者明顯比未發(fā)生甲基化的患者使用烷化劑的療效好，其總體生存率和無進(jìn)展生存率更高。MGMT啟動(dòng)子區(qū)甲基化對(duì)膠質(zhì)瘤一線化療藥物TMZ治療膠質(zhì)瘤的化療療效具有預(yù)測(cè)價(jià)值，且是獨(dú)立的預(yù)后較好的指示指標(biāo)。MGMT啟動(dòng)子未甲基化者從TMZ常規(guī)治療方案中獲益較小，應(yīng)對(duì)這類患者采用更有效的有助于克服耐藥的其他化療方案。

本次受檢者未檢出顯著臨床意義的變異，目前研究未發(fā)現(xiàn)這些類型變異與腫瘤發(fā)生有明確關(guān)系，罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)為普通風(fēng)險(xiǎn)。普通風(fēng)險(xiǎn)不能完全排除罹患腫瘤的可能，可能是環(huán)境因素、檢測(cè)基因范圍以外存在其他未知致病突變的風(fēng)險(xiǎn)。