耿瑋崢,李子豪,張 昊,馬壯壯,陳 偉

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科,吉林 長春130033)

人工關(guān)節(jié)作為金屬內(nèi)植物材料廣泛應(yīng)用于關(guān)節(jié)外科領(lǐng)域，取得了良好的臨床效果，但同時人工關(guān)節(jié)置換后易出現(xiàn)感染，據(jù)文獻(xiàn)報道[1]，假體周圍感染的發(fā)生均是由細(xì)菌感染引發(fā)的，而術(shù)中細(xì)菌直接種植是感染的最直接因素，約占全部感染的57.9%，處理頗為棘手，治療上需要進(jìn)行反復(fù)的清創(chuàng)，移除假體，其主要原因就是由于細(xì)菌生物膜(BBF)的形成。由于抗生素對于BBF的滲透非常困難，傳統(tǒng)的抗生素治療無論是單獨還是聯(lián)合使用都不能有效清除細(xì)菌，甚至還會導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。因此在目前情況下，預(yù)防感染就顯得尤為重要。碘伏(聚維酮碘)溶液作為一種常見的抗菌劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于關(guān)節(jié)手術(shù)中的局部沖洗、浸泡，盡管臨床實踐中在預(yù)防關(guān)節(jié)周圍感染效果顯著，但缺乏相關(guān)的基礎(chǔ)研究，臨床指南及使用標(biāo)準(zhǔn)。由于人工關(guān)節(jié)材料中廣泛存在鈦合金，金黃色葡萄球菌(SA)是關(guān)節(jié)感染最常見的致病細(xì)菌，本研究通過觀察聚維酮碘溶液在鈦板表面未完全形成BBF時，沖洗浸泡后的滅菌效果，為臨床在術(shù)后關(guān)閉切口前，對碘伏清除細(xì)菌的效果提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鈦合金板，由中國天津IRENE正天醫(yī)療器械廠家加工并提供;金黃色葡萄球菌(SA)，中日聯(lián)誼醫(yī)院檢驗科提供，聚維酮碘皮膚消毒液(上海利康高科技有限公司)；37℃恒溫培養(yǎng)箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠);胰蛋白胨的稀釋液(TPS)，磷酸鹽緩沖液等。

1.2 實驗分組與方法

1.2.1建立3組實驗樣本 (1)無菌清潔鈦合金板組：經(jīng)過高溫高壓消毒的鈦合金板。(2)碘伏浸泡鈦合金板組：沾染上微量金黃色葡萄球菌，但經(jīng)碘伏沖洗浸泡后的鈦合金板。(3)無菌鹽水沖洗鈦合金板組：沾染上微量金黃色葡萄球菌，但經(jīng)無菌生理鹽水反復(fù)沖洗后的鈦合金板。

1.2.2實驗方法 (1)細(xì)菌懸液的制備:試驗菌選擇金黃色葡萄球菌(ATCC6538),放入 37℃培養(yǎng)箱中，新鮮斜面培養(yǎng)24 h后取出,經(jīng)顯微鏡下確認(rèn)清楚后，用含胰蛋白胨的稀釋液(TPS)沖洗下菌苔，并制備成菌懸液。再用含 30 g/L牛血清白蛋白溶液作為稀釋配制試劑，配置成極低濃度的菌懸液(含1-2個細(xì)菌/0.25 ml)備用。(2)鈦合金表面細(xì)菌沾染樣本制備:將鈦合金盤進(jìn)行清潔、干燥、包裝、滅菌等預(yù)處理后備用，在百級手術(shù)室內(nèi)取3組無菌清潔鈦合金板，放入無菌24 孔板中。第一組設(shè)為無菌清潔鈦合金板，在百級手術(shù)間內(nèi)將無菌包裝打開，置于無菌24孔板中，滴入無菌鹽水1 ml放置；第二組設(shè)為碘伏浸泡鈦合金板組，將無菌包裝打開，置于無菌24 孔板中，外露在百級手術(shù)間內(nèi)，同時用制備好的菌懸液1 ml滴入表面，分別在無菌條件下，用碘伏分別在15 min，30 min，60 min，90 min時浸泡沖洗1 min；第3組設(shè)為無菌鹽水沖洗鈦合金板組，將無菌包裝打開，置于無菌24 孔板中充分暴露，同時用制備好的菌懸液1 ml滴入表面，在無菌條件下，用無菌生理鹽水分別在15 min，30 min，60 min，90 min時反復(fù)沖洗1 min。(3)懸液細(xì)菌定量測定：用 PBS將每枚鈦板沖洗3次，使表面未粘附的細(xì)菌脫落，并用超聲裂解、振蕩等方法使鈦合金板表面細(xì)菌基本脫落，再次收集。稀釋加入裝有 4.5 ml沖洗液的無菌試管中,混勻。中和 10 min,取樣液進(jìn)行活菌計數(shù)，試驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 實驗結(jié)果

通過實驗發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌能夠附著在金屬鈦板上存活，繁殖，經(jīng)統(tǒng)計：無菌鹽水沖洗鈦板組活菌率約85%，碘伏浸泡鈦板組活菌率約1%，無菌清潔鈦板組活菌率95%以上，統(tǒng)計學(xué)意義顯著(P<0.05)，見表1。

表1 細(xì)菌活菌率統(tǒng)計表

無菌清潔鈦板組隨著時間的延長，有細(xì)菌在其表面沾染，碘伏浸泡鈦板組經(jīng)過碘伏的沖洗浸泡幾乎無細(xì)菌存活，而無菌鹽水沖洗鈦板組隨著時間的延長，細(xì)菌開始出現(xiàn)指數(shù)生長情況，見表2。

表2 細(xì)菌計數(shù)(高倍顯微鏡下，每視野)統(tǒng)計表

3 討論

3.1 碘伏對附著在金屬表面細(xì)菌作用的影響

關(guān)于文獻(xiàn)選取，通過檢索維普網(wǎng)、中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫、PubMed、CNKI全文數(shù)據(jù)庫等國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫，收集關(guān)于碘伏對于鈦合金材料的相關(guān)性研究。檢索詞包括：碘伏術(shù)后抗菌應(yīng)用、金黃色葡萄球菌感染、骨關(guān)節(jié)術(shù)后感染、鈦合金材料抗菌應(yīng)用、iodophor、Bone OR等。再通過關(guān)鍵詞及文獻(xiàn)摘要排除明顯不符合的文章后，根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)包括：①金黃色葡萄球菌對鈦合金表面影響的研究②碘伏對鈦合金表面看抗菌效果的研究③骨關(guān)節(jié)術(shù)后感染的并發(fā)癥的探討等。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：①與鈦合金材料抗菌無關(guān)的文獻(xiàn)②內(nèi)容陳舊，觀點仍存在廣泛爭議的文獻(xiàn)等。我們不難發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌一般初始以浮游狀態(tài)沾染被污染區(qū)域，數(shù)小時致數(shù)日完成在假體，骨界面，組織等區(qū)域的定植。隨著浮游細(xì)菌吸附于假體表面，通過相互粘連、包裹形成生物膜，有研究報道[2]生物膜內(nèi)細(xì)菌與浮游分散狀態(tài)相比，耐藥性提高了10-1 000 倍。因此，污染持續(xù)時間越長，越不利于徹底清除細(xì)菌。碘伏對浮游菌有很強(qiáng)的殺滅作用，可以用來預(yù)防手術(shù)感染。但是對于已經(jīng)形成的BBF，碘伏很難殺滅其中的細(xì)菌。Nakagawa[3]和Hoang[4]報道單純應(yīng)用碘伏溶液不能清除 BBF，這是因為BBF是細(xì)菌分泌的多糖、纖維蛋白和脂蛋白等物質(zhì)粘附于生物材料形成的并能將細(xì)菌自身包裹于其中的膜樣復(fù)合物，如關(guān)節(jié)假體表面發(fā)熱膜狀物質(zhì)，BBF能增強(qiáng)細(xì)菌對外界刺激的耐受力及抗菌藥物的耐藥性。近年來，BBF對抗菌藥物機(jī)槍的抵抗力也成為臨床上難治性感染的重要原因之一。研究表明[5-6]在處理細(xì)菌污染創(chuàng)面時，特別是細(xì)菌沾染在關(guān)節(jié)假體上面，必須要及時處理才能控制細(xì)菌的污染，防止感染的發(fā)生。因此，在目前的階段下，提前預(yù)防，積極預(yù)防，主動預(yù)防應(yīng)該是防止人工關(guān)節(jié)周圍感染發(fā)生的最佳方式，手術(shù)中關(guān)閉創(chuàng)口的時候，再次清理滅菌就顯得格外重要[7]。此次研究表明，90 min內(nèi)沾染在金屬表面的細(xì)菌，應(yīng)用碘伏進(jìn)行浸泡和沖洗，能夠?qū)⒏∮魏驼慈驹诮饘俦砻娴募?xì)菌完全消滅。

3.2 沖洗液對附著金屬表面細(xì)菌的作用

手術(shù)沖洗對預(yù)防術(shù)后感染非常重要，研究表明[8]沖洗可以大大減少創(chuàng)口受到可能存在污染區(qū)域的細(xì)菌數(shù)量，還可以清除手術(shù)創(chuàng)口內(nèi)失去血供容易成為細(xì)菌的良好培養(yǎng)基的組織碎屑，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)熱凝血塊，同時沖洗可以增加手術(shù)部位的組織局部抵抗力，減少炎性反應(yīng)，達(dá)到降低感染的目的。但對于人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)的創(chuàng)口來講，存在人工金屬材料，細(xì)菌往往會沾染或黏附在表面，如不及時清理，將逐漸形成BBF，是人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)后關(guān)節(jié)感染難以治愈的原因。如金黃色葡萄球菌是人工關(guān)節(jié)置換最主要的致病菌，生物膜將保護(hù)細(xì)菌面對抗生素，機(jī)體免疫及殺菌劑的攻擊。大量文獻(xiàn)表明[9-11]當(dāng)細(xì)菌處于浮游狀態(tài)時，沖洗將起到積極作用。我們知道在手術(shù)過程中，盡管是無菌操作，但經(jīng)過數(shù)小時開放性手術(shù)操作，很難避免空氣中的細(xì)菌沾染或術(shù)中不經(jīng)意直接沾染都有可能造成術(shù)區(qū)的污染，而沖洗將是我們在關(guān)閉切口前的最后抗菌措施，能否有效避免傷口污染發(fā)展為感染,何種沖洗液預(yù)防感染的效果好一直是外科醫(yī)生需要深入研究的問題。李曉華等[12]研究表明，當(dāng)細(xì)菌進(jìn)入創(chuàng)口與假體接觸后，會在假體表面產(chǎn)生一種細(xì)胞外多黏質(zhì)物質(zhì)(extracellular slime substance，ESS)，當(dāng)細(xì)菌處在游離狀態(tài)沾染在假體表面時，沖洗就顯得很重要，它可以破壞沾染在假體表面的 ESS，從而可以達(dá)到清除細(xì)菌的目的。目前常用術(shù)區(qū)沖洗液包括：生理鹽水，高滲鹽水，抗生素生理鹽水沖洗液，化學(xué)試劑(包括碘伏，過氧化氫)等，但能夠在最后關(guān)閉手術(shù)切口前確切徹底殺滅和清除細(xì)菌的沖洗液不多，研究發(fā)現(xiàn)[13]高滲鹽水，生理鹽水，抗生素鹽水，過氧化氫都可以清洗掉和殺滅大部分沾染的細(xì)菌，但很難能達(dá)到徹底滅菌的功能，存在污染的風(fēng)險。研究表明[14]碘伏依靠其氧化和碘化菌體內(nèi)巰基化合物、肽類和蛋白質(zhì)可完全殺滅細(xì)菌，而對于碘伏能否徹底殺滅附著在內(nèi)植入金屬材料細(xì)菌缺乏了解，我們此次進(jìn)行的對比試驗表明，碘伏溶液通過浸泡具有殺滅附著在金屬表面的金黃色葡萄球菌的能力，即使細(xì)菌仍沾染在金屬表面，也能夠被殺滅，可以消除污染的隱患。我們可以通過統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在污染的鈦合金表面，應(yīng)用碘伏浸泡和沖洗后，即使90 min后仍然保持無污染或極低沾染狀態(tài)，而生理鹽水沖洗組已經(jīng)發(fā)生污染，每個階段的沖洗能夠減少和控制細(xì)菌的數(shù)量，但不能控制殘留細(xì)菌的繁殖，金黃色葡萄球菌開始成指數(shù)生長，且無法徹底清除金屬表面殘留的細(xì)菌。而無菌鈦板組，在暴露的手術(shù)室環(huán)境中，長時間也出現(xiàn)細(xì)菌沾染情況。這些都表明，能否有效殺滅細(xì)菌沖洗和浸泡是防治感染的關(guān)鍵。

4 文章的局限性

①骨科術(shù)后感染的菌種非常豐富，本文僅對最為常見之一的金黃色葡萄球菌進(jìn)行了研究，存在單一性；②我們未對現(xiàn)實中臨床病例中抗菌效果進(jìn)行病例調(diào)查、研究，也未對患者進(jìn)行隨訪。③臨床中我們碘伏濃度還有多種，其是否對金黃色葡萄球菌具有更好的影響還有待于進(jìn)一步探究。不過隨著醫(yī)學(xué)科研的不斷進(jìn)步以及醫(yī)療水平的提高，碘伏(聚維酮碘)的作用及應(yīng)用一定會在相關(guān)領(lǐng)域被進(jìn)一步驗證。