楊錦容,蘇雅丹,朱競繁,巫清鵬

(1.惠州市中心人民醫(yī)院 兒科,廣東 惠州516000；2.惠州市第六人民醫(yī)院 兒科,廣東 惠州516211；3.惠州市第六人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,廣東 惠州516200；4.廣東省河源市婦幼保健院 發(fā)育行為?？?廣東 河源517300)

自閉癥(ASD)為神經(jīng)行為發(fā)育障礙，臨床主要表現(xiàn)為社交障礙、興趣狹窄、刻板行為[1]，可能與早期腸道菌群失調(diào)、免疫狀態(tài)異常相關(guān)，自閉癥發(fā)生后，患兒可出現(xiàn)胃腸脹氣、腹瀉、便秘等腸胃功能紊亂[2]。研究顯示[3]，腸道菌群的改變可促進(jìn)自閉癥的發(fā)展，且自閉癥可導(dǎo)致患兒免疫系統(tǒng)失調(diào)，T淋巴細(xì)胞發(fā)生改變。Ki-67高表達(dá)于增殖細(xì)胞，在多種癌癥的診斷中具有重要意義[4]?；诖?，本文分析T細(xì)胞亞群中Ki-67的表達(dá)及與自閉癥兒童腸道菌群結(jié)構(gòu)、核心癥狀的關(guān)聯(lián)及價值研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2020年4月-2021年4月惠州市中心人民醫(yī)院收治的50例自閉癥兒童為研究對象，作為研究組，另外選取來院體檢的50例典型發(fā)育兒童作為對照組，兩組一般資料具有可比性(P>0.05)。本研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：患兒均符合《孤獨癥譜系障礙兒童早期識別篩查和早期干預(yù)專家共識》[5]中對于自閉癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：存在嚴(yán)重軀體障礙，神經(jīng)發(fā)育出現(xiàn)障礙，存在其他慢性、急性疾病，患兒存在腦損傷，患有感染性疾病。

1.2 方法

1.2.1Ki-67表達(dá)水平檢測 采集兩組兒童空腹靜脈血5 ml，以離心半徑15 cm，轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心處理10 min，提取上層清液，于-80℃保存，待檢。使用抗CD3，抗CD4，抗CD8，抗CXCR4，抗CXCR7，抗CD45R，抗HLA-DR，抗Ki-67，抗GATA3，抗Helios和抗FOXP3抗體染色。固定細(xì)胞并通透，使用FC 500流式細(xì)胞儀Beckman Coulter使用CXP軟件采集和分析數(shù)據(jù)。使用Trizol試劑從PBMC中提取RNA并根據(jù)試劑盒說明步驟進(jìn)行定量。用Nandrop分光光度計測定RNA濃度。使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。使用SYBR Green預(yù)混液進(jìn)行定量RT-PCR。測定中使用的引物如下：Ki-67，F(xiàn)：5-GGATCGTCCCAGTGGAAGAG-3′，R：5′-TCTCGTGGGCCACATTTTC-T-3′；GAPDH，F(xiàn)： 5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′，R： 5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′。數(shù)據(jù)以Ki-67相對GAPDH的mRNA表達(dá)的變化表示。

1.2.2腸道菌群檢測 采集所有兒童新鮮糞便，放于-80℃，保存，待檢。提取糞便中DNA，采用MiSeq對其進(jìn)行檢測，后采用SiLva數(shù)據(jù)庫對其腸道菌群多樣性、腸道菌群門水平檢測。

1.2.3ABC評分檢測 采用孤獨癥行為量表(ABC)對患兒病情嚴(yán)重程度進(jìn)行評價，該量表共5個維度，評分越高，患兒病情越嚴(yán)重。采用SRS量表評估患兒社交障礙情況，分?jǐn)?shù)越高，癥狀越嚴(yán)重。采用CARS量表評估患兒孤獨癥狀，分?jǐn)?shù)越高，癥狀越嚴(yán)重。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 T細(xì)胞亞群中Ki-67的表達(dá)水平

如表1所示，與對照組相比，研究組患兒CD3+、CD4+、CD8+、CXCR4、CXCR7、CD45R、HLA-DR、GATA3細(xì)胞產(chǎn)生的Ki-67表達(dá)水平較高，Helios、FOXP3細(xì)胞產(chǎn)生的Ki-67表達(dá)水平較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組腸道菌群結(jié)構(gòu)比較

如表2所示，與對照組相比，研究組患兒Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)降低，Simpson指數(shù)升高，擬桿菌門、放線菌門水平降低，厚壁菌門、變形菌門水平升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表1 對照組與研究組患兒T細(xì)胞表面受體細(xì)胞中Ki-67表達(dá)水平

表2 對照組與研究組患兒腸道菌群結(jié)構(gòu)比較

2.3 各組核心癥狀比較

如表3所示，與對照組相比，研究組患兒ABC、SRS、CARS評分升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表3 各組核心癥狀比較

2.4 Ki-67表達(dá)水平對自閉癥兒童腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果

CD3+、CD4+、CD8+、CXCR4、CXCR7、CD45R、HLA-DR、GATA3細(xì)胞中Ki-67表達(dá)截斷值為(0.947，0.910，0.955，1.234，0.915，1.880，1.740，0.915，0.545，0.615)，本研究中，5項及以上Ki-67表達(dá)異常，定為Ki-67異常組(n=32)，其余為Ki-67非異常組(n=18)。如表4所示，與Ki-67非異常組相比，調(diào)整其混雜因素，發(fā)現(xiàn)Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門為影響患兒Ki-67異常的危險因素，Ki-67異常組患兒Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、擬桿菌門、放線菌門低于Ki-67非異常組，Simpson指數(shù)、厚壁菌門、變形菌門高于Ki-67非異常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表4 Ki-67表達(dá)水平對自閉癥兒童腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果

2.5 Ki-67表達(dá)水平對自閉癥兒童核心癥狀的影響結(jié)果

如表5所示，與Ki-67非異常組相比，調(diào)整其混雜因素，發(fā)現(xiàn)ABC、SRS、CARS為影響患兒Ki-67異常的危險因素，Ki-67異常組患兒ABC、SRS、CARS評分高于Ki-67非異常組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表5 Ki-67表達(dá)水平對自閉癥兒童核心癥狀的影響結(jié)果

3 討論

Ki-67在T細(xì)胞中表達(dá)較高，其表達(dá)水平可影響患者免疫功能，導(dǎo)致其發(fā)生免疫障礙[6]。趨化因子受體可促進(jìn)神經(jīng)疾病的發(fā)展，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞T細(xì)胞活化，CXCR4表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮功能，CXCR7表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、大腦神經(jīng)元，可促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展[7-8]。研究顯示[9-10]，孕婦體內(nèi)CXCR4表達(dá)水平升高可使新生兒自閉癥發(fā)生率升高。HLA-DR為甲狀腺功能減退、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫性糖尿病易感標(biāo)志物，可促進(jìn)自閉癥的發(fā)展[11]。GATA3表達(dá)水平升高可使5-羥色胺能加速神經(jīng)元發(fā)育，導(dǎo)致自閉癥的發(fā)生，GATA3還可調(diào)節(jié)多巴胺β羥化酶活性，表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，腦中區(qū)域[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，自閉癥兒童CXCR4、CXCR7、HLA-DR、GATA3細(xì)胞中Ki-67表達(dá)水平升高，表明CXCR4、CXCR7、HLA-DR、GATA3細(xì)胞中Ki-67表達(dá)水平升高與兒童免疫功能失調(diào)、患兒行為、核心癥狀的改變有關(guān)，以至于其溝通能力、行為能力出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致自閉癥的發(fā)生。本文研究顯示，Helios細(xì)胞Ki-67在ASD受試者中表達(dá)顯著減少，這可能與這些個體的免疫功能障礙有關(guān)。FOXP3在平衡過度活躍的免疫系統(tǒng)方面起著至關(guān)重要的作用，其缺乏可能與自身免疫性疾病和ASD有關(guān)[14]。

腸道菌群與機(jī)體之間存在動態(tài)平衡，其多樣性降低，可引起炎性腸性病、精神分裂癥、免疫力降低、以及抑郁癥的發(fā)生[16-17]。本文研究發(fā)現(xiàn)，自閉癥兒童中腸道菌群多樣性降低，可使其腸道菌群失衡，變形菌門豐富度升高，可使機(jī)體內(nèi)腸道菌群發(fā)生紊亂，并使腸道炎性反應(yīng)增加，應(yīng)激反應(yīng)升高，導(dǎo)致自閉癥的發(fā)生。