張日婷，趙弘卿，王洵，嚴(yán)玉蘭

據(jù)2021年癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，肺癌為40歲以上男性癌癥患者和60歲以上女性癌癥患者的主要死亡原因，病死人數(shù)超過(guò)乳腺癌、前列腺癌及大腸癌總和[1]。根據(jù)組織學(xué)類型和預(yù)后分類，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌類型的85%，進(jìn)一步可細(xì)分為腺癌(44%)、鱗狀細(xì)胞癌(23%)、大細(xì)胞癌(4%)及未分型的肺癌(29%)，其中肺腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，在NSCLC中發(fā)病率最高[2]。circRNA于1976年首次在RNA病毒中發(fā)現(xiàn)，由前體mRNA反向剪接循環(huán)產(chǎn)生，其3'和5'端相連形成共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)，無(wú)線性RNA 5'帽結(jié)構(gòu)或3'聚腺苷酸尾巴，比線性RNA更穩(wěn)定[3]，有可能為多種疾病的生物標(biāo)記物。研究[4]表明，circRNA通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)生物學(xué)過(guò)程，如作為海綿競(jìng)爭(zhēng)miRNA反應(yīng)元件，調(diào)控相應(yīng)靶基因表達(dá)、調(diào)節(jié)RNA Pol II轉(zhuǎn)錄及指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。有證據(jù)[5]表明，許多物種的標(biāo)本中存在大量circRNA，在多種疾病的病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。circRNA的異常表達(dá)可能與肺腺癌的發(fā)病有關(guān)。

既往研究[6-7]表明，來(lái)源于RUNX家族轉(zhuǎn)錄因子1(RUNX1) 的hsa_circ_0002360在多種腫瘤標(biāo)本中表達(dá)異常，如非小細(xì)胞肺癌、胃癌、舌鱗狀細(xì)胞癌，可通過(guò)靶向結(jié)合miR-629-3p，抑制抗癌基因PDLIM4表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲。抑制hsa_circ_0002360可改善NSCLC對(duì)紫杉醇的耐藥性[8-9]。hsa_circ_0002360在肺腺癌中的生物學(xué)功能尚未完全闡明。與微陣列分析相比，高通量測(cè)序(RNA-seq)是一種可識(shí)別未知核苷酸序列的開(kāi)放技術(shù)，為探究circRNA的細(xì)胞類型特異性、組織特異性及其生物學(xué)功能提供了新的線索。本研究通過(guò)高通量測(cè)序方式，篩選肺腺癌組織異常表達(dá)的circRNA，并采用qRT-PCR技術(shù)放大樣本驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，構(gòu)建circRNA/miRNA/mRNA(ceRNA)網(wǎng)絡(luò)互作圖分析部分circRNA與miRNA和mRNA的關(guān)系圖，采用克隆實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及Tranwell侵襲實(shí)驗(yàn)分析circRNA對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，為探索circRNA參與肺腺癌發(fā)病的機(jī)制提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院胸外科接受部分或根治性手術(shù)的肺腺癌患者25例，其中男14例，女11例；平均年齡(67.0±4.1)歲；腫瘤分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期6例，Ⅲ期8例，Ⅳ期6例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理確診為原發(fā)性肺腺癌；(2)術(shù)前未進(jìn)行化療、放療及其他輔助治療；(3)患者無(wú)高血壓、糖尿病或心血管疾病等基礎(chǔ)性疾??；(4)患者及其家屬知曉本試驗(yàn)所有研究方案,并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他腫瘤的患者；(2)意識(shí)不清者；(3)臨床信息不完善。術(shù)中均切取患者肺腺癌組織和癌旁正常組織冷凍備用，其中5對(duì)標(biāo)本作為高通量測(cè)序，20對(duì)標(biāo)本作為qRT-PCR試驗(yàn)。本項(xiàng)目經(jīng)江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和質(zhì)量控制(QC) 使用TRIzol試劑(Ambion Life Technologies公司，美國(guó))提取標(biāo)本總RNA。紫外分光光度儀NanoDrop 2000(Thermo Scientific公司,美國(guó))檢測(cè)總RNA的濃度及質(zhì)量。合格標(biāo)準(zhǔn)：OD260值/OD280值為1.8～2.1。儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 circRNA高通量測(cè)序 選取1.2.1提取的5對(duì)總RNA標(biāo)本，采用Epicenter Ribo-Zero rRNA試劑盒(Illumina公司，美國(guó))和RNase R酶(Epicenter公司，美國(guó))先后處理總RNA，去除核糖體和線性RNA。將處理后的RNA裂解成片段，準(zhǔn)備cDNA合成和PCR擴(kuò)增，并修飾末端和連接前體。采用TruSeq Stranded Total RNA HT/LT試劑盒(Illumina公司，美國(guó))構(gòu)建高通量測(cè)序(RNA-seq)文庫(kù)，Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent 公司，美國(guó))生物分析儀行質(zhì)量控制和評(píng)估。從Illumina HiSeq X10測(cè)序儀中獲取配對(duì)末端讀數(shù)，Q30進(jìn)行質(zhì)量控制。在3'修剪后，使用Cutadapt軟件(版本1.9.3)刪除含N3序列的讀數(shù)小于50 bp或低質(zhì)量的reads。測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)Bowtie2軟件[10]與人類基因組(NCBI xl_ref_ Xenopus_laevis_v2)比對(duì)，并使用Find_circ軟件(如CIRI)[11]識(shí)別circRNA。差異倍數(shù)fold change>2或<0.5，t檢驗(yàn)P值<0.05表示表達(dá)存在差異。采用R軟件limma包(R版本3.3.1)處理數(shù)據(jù)。測(cè)序程序和數(shù)據(jù)分析由OE生物技術(shù)公司執(zhí)行(中國(guó)上海)。

1.2.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 選取1.2.1提取的剩余20對(duì)總RNA標(biāo)本，采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)測(cè)序結(jié)果中異常表達(dá)倍數(shù)排名前10位(5個(gè)上調(diào)和5個(gè)下調(diào))的10個(gè)circRNA。circRNA的特異性引物由Generay Biotech公司(捷瑞生物工程有限公司，中國(guó)上海)設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表1。采用HiScript II Q RT SuperMix試劑盒合成cDNA(諾唯贊生物科技股份有限公司，中國(guó)南京)，以cDNA為模板于LightCycle?480 II實(shí)時(shí)PCR儀器(Roche,瑞士)上行實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算2組間差異circRNA。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次后分析數(shù)據(jù)。

表1 qRT-PCR circRNA引物

1.2.4 生物信息學(xué)分析 選取高通量測(cè)序中肺腺癌組織異常表達(dá)倍數(shù)排名前5位的5個(gè)上調(diào)circRNA，構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)。采用miRanda軟件預(yù)測(cè)circRNA的靶向miRNA，TargetScan、RegRNA及miRTarBase軟件預(yù)測(cè)miRNA與circRNA、mRNA間的靶向互作關(guān)系。Cytoscape軟件繪制circRNA/miRNA/mRNA網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.5 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞中心，中國(guó)上海)，接種于6孔板中，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合至50%后，分為空白對(duì)照組(正常A549細(xì)胞,空白對(duì)照組)、陰性對(duì)照組(siRNA對(duì)照組)及實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染si-hsa_circ_0002360的A549細(xì)胞,siRNA組)，分別以LipoFiter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、si-NC試劑及si-circRNA試劑轉(zhuǎn)染稀釋、混合后加入人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中[12]，qRT-PCR檢測(cè)陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中hsa_circ_0002360表達(dá)水平。

1.2.6 克隆實(shí)驗(yàn) 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至6孔板中，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，待再次干預(yù)，磷酸鹽平衡生理鹽水(PBS)清洗3次，每孔加入多聚甲醛1 mL，置于4 ℃冰箱內(nèi)固定細(xì)胞30 min，PBS再清洗3次，每孔加入結(jié)晶紫1 mL,常溫染色10 min，PBS清洗至背景干凈，靜置干燥。記錄細(xì)胞克隆數(shù)，克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞總數(shù))×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至6孔板中，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞單層貼壁達(dá)90%時(shí)，取無(wú)菌10 μL槍頭沿直線每孔劃2條線，PBS清洗3次,去除脫落細(xì)胞,加入無(wú)血清培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h，分別于劃痕后0、24 h用顯微鏡觀察拍照，ImageJ軟件分析遷移能力。

1.2.8 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 采用鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室測(cè)量細(xì)胞侵襲能力。小室下層加入含有10% FBS的培養(yǎng)基，將懸浮在不含F(xiàn)BS的RPMI-1640培養(yǎng)基中的各組細(xì)胞(5×104細(xì)胞/孔)接種到上層小室中，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，棉簽去除上層小室中細(xì)胞，4%多聚甲醛固定濾膜另側(cè)細(xì)胞30 min， 0.1%結(jié)晶紫染色10 min。統(tǒng)計(jì)9個(gè)視野中計(jì)數(shù)細(xì)胞，并在顯微鏡下以400×放大倍數(shù)拍照。

2 結(jié)果

2.1 高通量測(cè)序肺腺癌患者的一般資料 本研究選取5例肺腺癌患者的癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行高通量RNA測(cè)序，5例患者的臨一般資料見(jiàn)表2。

表2 高通量測(cè)序肺腺癌患者的一般資料

2.2 circRNA高通量測(cè)序結(jié)果 測(cè)序結(jié)果顯示，肺腺癌組織中285個(gè)circRNA表達(dá)異常(差異倍數(shù)>2.0或<0.5，P值<0.05)，其中102個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào)，183個(gè)circRNA表達(dá)下調(diào)(圖1A，1B)。

1A 肺腺癌組織(Y軸)與癌旁正常組織(X軸)間cricRNA表達(dá)差異的散點(diǎn)圖 1B 2組間異常表達(dá)circRNA的火山圖圖1 高通量測(cè)序中2組標(biāo)本異常表達(dá)circRNA 分布圖

2.3 肺腺癌組織和癌旁正常組織間circRNA表達(dá)水平比較 采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)20對(duì)肺腺癌組織和癌旁正常組織中高通量測(cè)序結(jié)果差異表達(dá)倍數(shù)前10位的10個(gè)circRNA(5個(gè)上調(diào)和5個(gè)下調(diào))表達(dá)水平。其中2個(gè)circRNA引物設(shè)計(jì)不成功，在qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中移除。結(jié)果顯示，肺腺癌組織中hsa_circ_0000264、hsa_circ_0039-161、hsa_circ_0002360及hsa_circ_000-6276表達(dá)高于癌旁正常組織， hsa_circ_0004062、hsa_circ_0004417、hsa_circ_0001320及hsa_circ_0004777表達(dá)低于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2A)，且異常表達(dá)方向與高通量測(cè)序結(jié)果一致(圖2B)。hsa_circ_0002360為表達(dá)差異倍數(shù)最高的circRNA。

2.4 生物信息學(xué)分析 選取高通量測(cè)序結(jié)果中肺腺癌組織表達(dá)上調(diào)差異倍數(shù)前5位的5個(gè)circRNA構(gòu)建circRNA/miRNA/mRNA網(wǎng)絡(luò)互作圖。結(jié)果顯示， 5個(gè)表達(dá)上調(diào)circRNA對(duì)應(yīng)28個(gè)靶向miRNA， 82個(gè)相關(guān)mRNA。其中與hsa_circ_0002360結(jié)合的miRNA有has-mi-6769b-5p、has-mi-3147、has-mi-3620-5p、has-mi-296-3p、has-mi-1268b、has-mi-684、has-mi-6848-5p、has-mi-762及has-mi-4739，同其相關(guān)的mRNA有WARS、PHF19、HILPDA、EPB41、MSN、PRELP、PDE4A、PHLDA2、ARHGAP40、TET3、SYNGR2及PODXL。

2A 2組肺組織中circRNA表達(dá)水平(*P<0.05, **P<0.01) 2B RNA-Seq和qRT-PCR結(jié)果中10個(gè)circRNA中的差異倍數(shù)變化(FCs)圖2 肺腺癌組織和癌旁正常組織間circRNA表達(dá)水平比較

5A hsa_circ_0002360沉默后3組A549細(xì)胞克隆增殖視野 5B 3組細(xì)胞增殖結(jié)果比較柱狀圖(P<0.05) 5C hsa_circ_0002360沉默后3組A549細(xì)胞遷移視野 5D 3組細(xì)胞遷移結(jié)果比較柱狀圖(P<0.05) 5E hsa_circ_0002360沉默后3組A549細(xì)胞侵襲視野 5F 3組細(xì)胞侵襲結(jié)果比較柱狀圖(P<0.05)圖5 Hsa_circ_000236沉默后肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力變化圖(*P<0.05)

圖3 circRNA/miRNA/mRNA網(wǎng)絡(luò)互作圖

2.5 si-RNA干預(yù)對(duì)肺腺癌細(xì)胞株hsa_circ_0002360表達(dá)的影響 在A549細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組hsa_circ_0002360表達(dá)低于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

2.6 hsa_circ_0002360沉默對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響 克隆實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)驗(yàn)組肺腺癌細(xì)胞增殖率低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(圖5A、5B)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞遷移能力低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(圖5C、5D)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲力低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(圖5E、5F)。

圖4 si-RNA干預(yù)后2組細(xì)胞株hsa_circ_000236表達(dá)水平柱狀圖(*P<0.05)

3 討論

肺癌有效治療方法仍為外科手術(shù)治療，而臨床上約65%的NSCLC患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)最佳手術(shù)治療時(shí)機(jī)。NSCLC 5年生存率不足15%，關(guān)于NSCLC發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制仍不清楚[13]。隨著新一代測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，circRNA在真核細(xì)胞中的調(diào)控功能開(kāi)始受到關(guān)注。研究[14]表明，circRNA參與多種疾病發(fā)病過(guò)程，包括自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及多種腫瘤，可能為新的生物標(biāo)記物和潛在的治療靶點(diǎn)。

circRNA可能與腫瘤發(fā)病、腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后有關(guān)。circRNA BIRC6通過(guò)海綿吸附作用吸附miRNA-145，影響NSCLC細(xì)胞增殖[15]；circRNA-CHD2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA-30e-3p，上調(diào)MDM2靶向癌基因，抑制腫瘤抑癌基因TP53表達(dá)，從而調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[16]；circ0072088通過(guò)調(diào)節(jié)miR-545-3p/STAT3軸，促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[17]。然而，circRNA在肺腺癌發(fā)病中的作用機(jī)制尚不明確。

本研究通過(guò)高通量測(cè)序篩選人肺腺癌組織中異常表達(dá)circRNA譜。結(jié)果顯示，肺腺癌組織中共有102個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào)，183個(gè)表達(dá)下調(diào)。差異倍數(shù)排名前5位上調(diào)circRNA為hsa_circ_0000264、hsa_circ_0039161、hsa_circ_0002360、hsa_circ_0006276及hsa_circ_0009128，前5位下調(diào)circRNA為hsa_circ_0004062、hsa_circ_0004417、hsa_circ_0003176、hsa_circ_0001320及hsa_circ_0004777。放大樣本后qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。其中hsa_circ_0002360差異倍數(shù)最高，猜測(cè)hsa_circ_0002360與肺腺癌發(fā)病相關(guān)。

circRNA可通過(guò)海綿吸附作用結(jié)合靶向miRNA或蛋白質(zhì)，影響疾病進(jìn)展[18]。如circPRKCI包含miR-545和miR-589結(jié)合位點(diǎn)，能夠通過(guò)海綿吸附作用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-545和miR-589，抑制其活性，從而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[19]；circTP63通過(guò)ceRNA網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子FoxM1表達(dá)，影響肺鱗癌進(jìn)展[20]；hsa_circRNA_104348通過(guò)調(diào)節(jié)miR-187-3p/RTKN2軸和激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)肝癌進(jìn)展[21]。本研究中ceRNA網(wǎng)絡(luò)互作圖分析顯示，hsa_circ_0002360可與多個(gè)miRNA靶向結(jié)合，提示hsa_circ_0002360可能通過(guò)ceRNA網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系抑制靶向miRNA，從而影響靶基因的表達(dá)，最終參與肺腺癌的發(fā)病機(jī)制。

腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及遷移影響腫瘤分化程度，且影響腫瘤患者預(yù)后，術(shù)后多需輔以放療或化療，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。circRNA惡性腫瘤中以腫瘤抑制因子或致癌因子方式參與發(fā)病，如hsa_circ_0000467參與胃癌發(fā)病過(guò)程，表達(dá)水平與胃癌腫瘤分期存在相關(guān)性，沉默hsa_circ_0000467可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，被認(rèn)為是潛在的胃癌預(yù)后標(biāo)志物[22]。食道癌患者血漿癌基因SMAD7的circ-SMAD7表達(dá)下調(diào)，與TNM分期呈負(fù)相關(guān)，circ-SMAD7過(guò)表達(dá)可抑制食道癌細(xì)胞的遷移和增殖，而circ-SMAD7沉默后作用相反[23]。本研究中三代高通量測(cè)序結(jié)果和qRT-PCR結(jié)果均顯示，肺腺癌組織hsa_circ_0002360差異倍數(shù)最高；hsa_circ_0002360體外功能實(shí)驗(yàn)表明，hsa_circ_0002360影響肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。推測(cè)hsa_circ_0002360可作為致癌因子，增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞的惡性程度。

本研究存在不足之處，如qRT-PCR樣本量偏少，測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證說(shuō)服力有限；未能對(duì)差異表達(dá)的每個(gè)circRNA進(jìn)行大樣本驗(yàn)證；網(wǎng)絡(luò)互作圖僅分析了差異倍數(shù)前5位的circRNA與miRNA/mRNA的靶向互作關(guān)系；基因沉默僅探索了hsa_circ_0002360對(duì)腫瘤細(xì)胞活性的影響，而其表達(dá)是否與肺腺癌的分化程度、預(yù)后、其他病理類型肺癌及肺部疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性未深入探討。盡管如此，本研究結(jié)果可為circRNA參與肺腺癌發(fā)病機(jī)制的闡明提供了重要信息。

綜上所述，circRNA在肺腺癌組織表達(dá)異常，其中hsa_circ_0002360表達(dá)差異倍數(shù)最高，hsa_circ_0002360參與肺腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移過(guò)程可能為肺腺癌患者的潛在預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。