曾文輝，龔千鋒，楊民榮

1.江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330000；3.贛州市綜合檢驗(yàn)檢測(cè)院食品藥品檢測(cè)所，江西 贛州 341000

近年來(lái)，藥食兩用資源被廣泛地開(kāi)發(fā)利用，傳統(tǒng)入藥的植物，隨著研究的深入，也在某些功效上被加入到食品的目錄中。玳玳花為蕓香科植物玳玳花Citrus aurantium L.var.amaraEngl.（CALV）的花蕾［1］，具有理氣寬胸，和胃止嘔之功效。因其富含多種酚酸和黃酮成分［2］，可作茶飲以降糖、降脂等［3-4］。現(xiàn)代藥理研究表明［5-7］，玳玳花無(wú)明顯毒性并具有平喘祛痰、抗炎、抗氧化的作用。而對(duì)于化痰作用的有效成分卻鮮有報(bào)道。超高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜(UHPLC-QTOF-MS/MS)技術(shù)可在較短時(shí)間內(nèi)完成化學(xué)成分的分析，因此，本研究采用酚紅祛痰法對(duì)玳玳花不同提取部位進(jìn)行祛痰篩選，并采用UHPLC-QTOF-MS/MS 對(duì)有效部位進(jìn)行成分鑒定，以期為相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-30A 超高效液相色譜儀（日本島津公司）；Triple-TOF 5600 高分辨質(zhì)譜儀，配備ESI 離子源及Analyst 1.6 數(shù)據(jù)處理軟件、Peak View 數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)AB SCIEX 公司）；HC-3018R 型高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；Millipore-Simplicity 超純水處理系統(tǒng)（德國(guó)默克密理博公司），KQ-400DB 型超聲清洗機(jī)（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），AL204 型電子分析天平［Mettler Toledo 儀器（上海）有限公司］。

對(duì)照品：咖啡酸（批號(hào)：110885-201703）、橙皮苷（批號(hào)：110721-202019）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。隱綠原酸（批號(hào)：AKS-202015）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號(hào)：AKS-202112）、蕓香柚皮苷（批號(hào): AKS-202005）、木犀草素-7-O-葡萄糖苷（批號(hào): AKS-202024）、柚皮苷（批號(hào)：AKS-202113）均購(gòu)于成都艾博克生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。本實(shí)驗(yàn)收集到的玳玳花干燥花序樣品經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)龔千鋒教授鑒定為蕓香科植物玳玳花。

2 方法

2.1 酚紅祛痰法［8］

取昆明種小鼠 70 只［體重范圍18～20 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2021-0002］，雄性，隨機(jī)分為7 組，給藥組分別灌胃玳玳花水提取物（2.826 g/kg）、80%乙醇提取物（2.826 g/kg）、石油醚部位（0.156 g/kg）、乙酸乙酯部位（0.148 g/kg）、正丁醇部位（0.788 g/kg）（注：玳玳花臨床劑量為0.34 g/kg）?？瞻讓?duì)照組給以CMCNa 溶液，陽(yáng)性對(duì)照組給氯化銨（1 g/kg），每天 1 次，連續(xù) 7 d。末次給藥前16 h 禁食不禁水，于末次給藥30 min 后，腹腔注射0.2 ml 5% 酚紅溶液，30 min 后剝離氣管周?chē)M織，剪下從甲狀軟骨下到氣管分支處的一段氣管，放至盛有2 mL 生理鹽水的試管中，再加入1 mol/L NaOH 溶液0.1 mL，超聲震蕩10 min，以3 000 r/min 離心15 min，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)559 nm 處測(cè)吸光度（A），用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算酚紅排出量（μg/L）。

精密稱取酚紅12.5 mg，加5%碳酸氫鈉溶液完全溶解后，轉(zhuǎn)移至1 000 mL 容量瓶中，定容至刻度，配制成濃度為12.5 μg/mL 的酚紅溶液，并用5%碳酸氫鈉溶液等比稀釋成濃度為 12.500、6.250、3.125、1.562、0.781、0.391、0.195 μg/mL 的酚紅溶液，用酶標(biāo)儀于559 nm 處測(cè)定吸光度值（A）。以濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，繪制酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為A=0.092 5C+0.007 6，r=0.999 8。酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 酚紅的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 色譜和質(zhì)譜條件

2.2.1 液相條件采用島津ARC-C18 色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），流速為0.3 mL/min，梯度洗脫（0～2 min，B：5%；2～5 min，B：5% →9%；5～10 min，B：9% →15%；10～25 min，B：15% →20%；25～30 min，B：20%→25%；30～35 min，B：25%→75%；35～40 min，B：75% →5%；40～44 min，B：5%），柱溫35 ℃，進(jìn)樣量1.0 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件采用電噴霧電離源（ESI），負(fù)離子模式，質(zhì)量掃描范圍為m/z 80～1 200，噴霧電壓：-4 500 V，霧化氣溫度：600 ℃，氣簾氣：172.36 kPa，霧化氣和輔助氣：344.74 kPa；去簇電壓（DP）：-100 V；采用TOF-MS-IDA-MS/MS 方法采集數(shù)據(jù)，TOF/MS 一級(jí)預(yù)掃描和觸發(fā)的二級(jí)掃描TOF/MS/MS 離子累積時(shí)間分別為500、200 ms，CE 碰撞能量為-32 eV。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密取隱綠原酸、咖啡酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、蕓香柚皮苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、柚皮甙、橙皮苷對(duì)照品適量，分別加甲醇配制成0.01 mg/mL 的溶液，備用。

2.4 供試品溶液的制備

取玳玳花乙醇提取物粉末0.1 g，精密稱定，加入70%甲醇100 mL，超聲，濾液置12 000 r/min 離心機(jī)中離心，過(guò)0.22 μm 濾微孔濾膜濾過(guò)，即得。

3 結(jié)果

3.1 祛痰結(jié)果

結(jié)果表明，玳玳花水提取物、80%乙醇提取物、乙酸乙酯部位和正丁醇部位給藥后均能有效促進(jìn)小鼠呼吸道酚紅的分泌，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或P<0.01），而石油醚部位和空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表1 和圖2。由于乙醇提取物和正丁醇提取物都體現(xiàn)出促進(jìn)酚紅分泌的作用，但乙醇提取物富含的化合物比正丁醇多，因此著重研究乙醇提取物。

表1 玳玳花不同提取物對(duì)小鼠酚紅排泌的影響（，n=10）

表1 玳玳花不同提取物對(duì)小鼠酚紅排泌的影響（，n=10）

注：與空白組相比，a表示P<0.05，b表示P<0.01。

圖2 玳玳花不同提取物對(duì)小鼠酚紅排泌的影響

3.2 玳玳花的化學(xué)成分鑒定

用UHPLC-QTOF-MS/MS 對(duì)玳玳花成分進(jìn)行定性分析，結(jié)果見(jiàn)圖3 和表2。

表2 玳玳花乙醇提取物化學(xué)成分分析

圖3 玳玳花乙醇提取物負(fù)離子模式的總離子流

經(jīng)過(guò)Q-TOF-MS/MS 技術(shù)分析，初步鑒定了玳玳花中32 個(gè)化學(xué)成分，由化合物分離而言，多數(shù)為黃酮和有機(jī)酸類(lèi)?；衔? 和9 經(jīng)對(duì)照品比對(duì)后鑒定分別為隱綠原酸和咖啡酸，分別存在碎片離子m/z191 和135，這類(lèi)碎片為奎寧酸及?？鼘幩犷?lèi)的特征碎片，由此可推斷鑒定化合物1、8、22、23分別為奎寧酸、異綠原酸B、異綠原酸A 和異綠原酸C；黃酮類(lèi)成分主要為苷類(lèi)和苷元，苷類(lèi)化合物主要以葡萄糖、鼠李糖連接，而其他黃酮苷元（含失去糖基的）的特征碎片為m/z151，如化合物16、18、20、25、29 等化合物。

4 討論

本研究采用小鼠酚紅分泌實(shí)驗(yàn)研究玳玳花的祛痰作用，采用提取物及不同極性溶劑萃取而得不同部位的樣品，共同篩選祛痰作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇提取物和正丁醇部位具有顯著的祛痰作用。為了進(jìn)一步探究玳玳花祛痰作用的化學(xué)成分，傳統(tǒng)方法提取、分離、鑒定，所需材料和時(shí)間均耗費(fèi)巨大，為了快速便捷弄清祛痰作用的化學(xué)成分，本研究采用高分辨質(zhì)譜對(duì)玳玳花有效部位進(jìn)行了成分鑒定。

液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)能夠快速對(duì)復(fù)雜的化學(xué)成分體系進(jìn)行分析，本研究建立了基于UHPLC-QTOFMS/MS 聯(lián)用技術(shù)分析了玳玳花具有祛痰活性部位的化學(xué)成分，共鑒定成分32 個(gè)，主要為黃酮和酚酸類(lèi)成分，其中7 個(gè)成分經(jīng)對(duì)照品標(biāo)定。酚酸類(lèi)如咖啡酸、異綠原酸A、B、C 等，都具有抗炎、抗氧化的作用；黃酮類(lèi)如橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷等，具有祛痰、止咳等作用［9-11］，這些成分都為玳玳花在抗氧化、祛痰等作用提供較好的物質(zhì)基礎(chǔ)。以藥理篩選為導(dǎo)向，結(jié)合質(zhì)譜分離分析技術(shù)鑒定對(duì)應(yīng)的有效成分是研究中（成）藥快速、可靠的方法。此次研究為玳玳花的化學(xué)成分的研究及評(píng)價(jià)其在祛痰方面的功效提供參考，并為玳玳花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立及藥效機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)支撐。