謝佳雨,戴隆超,王娜,劉成,王令充

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院,江蘇 南京 210023;2.上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院,上海 200062)

氨基酸、多肽、蛋白質是動物藥中的主要成分,其中大多數(shù)還被現(xiàn)代研究證實是動物藥的特效成分[2]。目前已經(jīng)從土鱉蟲中分離出多種活性多肽及蛋白成分,這些成分具有較強的抗腫瘤[3]、抗凝血/抗血栓形成[4-5]、抗氧化[6-7]、降血脂[8-9]、護肝[10-11]與免疫調(diào)節(jié)[12-13]等活性。土鱉蟲多肽及蛋白類成分的研究難點聚焦于分離純化和結構鑒定，由于其過低的分離率與多樣化的組成成分,導致對土鱉蟲大分子成分的結構與功能認識嚴重缺乏。為此需要進一步發(fā)現(xiàn)功能性土鱉蟲大分子類成分及其藥理藥效的作用機制。

1 材料

土鱉蟲藥材購自上海中醫(yī)藥大學附屬舟山中醫(yī)院藥房,經(jīng)上海中醫(yī)藥大學普陀醫(yī)院劉成研究員鑒定為中藥土鱉蟲EupolyphagasinensisWalker雌蟲干燥體。正常人肝細胞株L-02、肝星狀細胞HSC-T6、肝癌細胞株SMMC-7721(中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫);胎牛血清(ABW,批號:AB-FBS0500);TGF-β(Perprotech,批號:100-21);BCA試劑盒(南京建成,批號:A045-4-2);Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒(南京建成,批號:G003-1);Cellulose DEAE-52(北京索萊寶,批號:20180308);葡聚糖凝膠G-100(上海源葉,批號:2110G100L12);色譜級乙腈(Tedia,批號:22075171);色譜級甲醇(Tedia,批號:22065054)。其他市售化學品和試劑均為分析級。

蛋白純化儀AKTA Purifier 95(PekinElmer,型號:Envision);LC-MS/MS(Thermo Fisher,型號:Q Exactive);高效液相色譜儀(Waters,型號:e2695);倒置熒光顯微鏡(Nikon,型號:Eclip SE Ti-S);倒置顯微鏡(Olympus,型號:CKX-31)。

2 方法

2.1 土鱉蟲活性粗蛋白的提取及分離

干燥土鱉蟲打粉,加入10倍體積量的20%乙醇,60～75 ℃回流提取2次,每次1 h,合并提取液,減壓濃縮(60 ℃)至3倍物料質量的體積,6 000 r·min-1離心15 min,收集上清液,冷凍干燥可得EE粉末,使用前-20 ℃避光存儲。

將65.19 g EE粉末溶解于30 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液中,將硫酸銨添加到溶液中至飽和狀態(tài),攪拌1 h后靜置3 h,10 000 r·min-1離心20 min,收集沉淀復溶后透析36 h以脫除鹽分,冷凍干燥可得27.59 g粗蛋白樣品EEP。

將粗蛋白EEP粉末復溶在30 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液中,并先后使用截留分子量為10 kDa與3 kDa的超濾離心管連續(xù)2次離心(6 660 r·min-1,15 min)分離操作,可按照分子量將EEP溶液分為3個蛋白部位截留液,分別收集并冷凍干燥,命名為EEPA(<3 kDa)、EEPB(3～10 kDa)及EEPC(>10 kDa)。

2.2 土鱉蟲蛋白分離物對L-02、SMMC-7721細胞增殖影響

L-02細胞、SMMC-7721細胞接種于含10%FBS、1%青-鏈霉素混合溶液的DMEM培養(yǎng)基中,置5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

將對數(shù)生長期L-02細胞接種于96孔板中(100 μL,6×104mL-1),接種24 h后,棄去培養(yǎng)基,加入不同濃度的土鱉蟲產(chǎn)物(EE、EEP、EEPA、EEPB、EEPC)培養(yǎng)基溶液培養(yǎng)24 h,加入MTT溶液(5 mg·mL-1,每孔20 μL),避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清,每孔再加入150 μL DMSO,震蕩10 min待結晶物溶解后,在酶標儀490 nm處讀取吸光值(A),考察土鱉蟲提取物在規(guī)定濃度范圍內(nèi)是否影響正常肝細胞L-02增殖與存活。細胞活力由下式計算:細胞活力=A實驗組/A空白對照組×100%。IC50值是從細胞活力對藥物濃度的反應曲線推導出來的。

將對數(shù)生長期肝癌細胞SMMC-7721接種于96孔板中(100 μL,6×104mL-1),采用上述MTT方法測定不同濃度的土鱉蟲產(chǎn)物(EE、EEP、EEPA、EEPB、EEPC)對肝腫瘤細胞SMMC-7721細胞活力的影響。

2.3 土鱉蟲蛋白分離物對活化的HSC-T6細胞增殖影響

HSC-T6的培養(yǎng)條件如2.2所述。將對數(shù)生長期肝星狀細胞HSC-T6接種于96孔板中(100 μL,6×104mL-1),采用上述MTT方法測定不同濃度的土鱉蟲產(chǎn)物(EE、EEP、EEPA、EEPB、EEPC)對正常HSC-T6細胞活力的影響。

取對數(shù)生長期的HSC-T6細胞,接種于96孔板中(100 μL,6×104mL-1)。實驗分為空白組、模型組和土鱉蟲各樣品實驗組,每組設6個復孔。除空白組外,各組細胞均添加細胞因子TGF-β(10 ng·mL-1)培養(yǎng)24 h用于激活HSC-T6細胞,此后細胞棄去上清,空白組添加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),實驗組添加在無毒濃度范圍之內(nèi)的土鱉蟲產(chǎn)物(EE、EEP、EEPA、EEPB、EEPC)進行孵育24 h。采用MTT法測定各組細胞活力。

2.4 土鱉蟲活性蛋白部位EEPC的分離純化

采用AKTA Purifier 95中壓色譜系統(tǒng)按照離子交換和凝膠滲透原理對EEPC進行分離純化[20]。首先進行DEAE-52 Cellulos陰離子柱層析(1.6 cm×20 cm)分離,EEPC溶解在30 mmol·L-1Tris-HCl 緩沖液(pH 8.0)中進樣,用不同濃度(0～1.0 mol·L-1)NaCl進行梯度洗脫,流速1 mL·min-1,280 nm檢測洗脫液餾分吸光度值,繪制EEPC的DEAE洗脫圖譜,并對峰面積積分,計算各峰占比。

收集EEPC在DEAE柱層析上分離的主要餾分PC3,在Sephadex G-100層析柱(1.6 cm×40 cm)上進一步純化,洗脫溶液為30 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH 8.0),流速0.75 mL·min-1,280 nm檢測洗脫液餾分吸光度值,繪制EEPC的主要餾分PC3的Sephadex G-100洗脫圖譜,并對峰面積積分,計算各峰占比。根據(jù)相對含量收集主要產(chǎn)物PC3-Ⅲ樣品,凍干保存用于后續(xù)實驗。

2.5 土鱉蟲分離蛋白PC3-Ⅲ的體外抗腫瘤與肝纖維化活性評價

將樣品PC3-Ⅲ按照一定的濃度分別與L-02及SMMC-7721細胞共同孵育,按照2.2中所述方法研究PC3-Ⅲ樣品對SMMC-7721體外增殖(MTT法)的影響,并將結果和EEPC進行對比。

使用Hoechst33342染色觀察EEPC與PC3-Ⅲ處理后SMMC-7721細胞凋亡情況。將SMMC-7712接種到24孔板中(500 μL,1.6×105mL-1),24 h后棄培養(yǎng)基給藥(EEPC與PC3-Ⅲ)。給藥48 h后棄去培養(yǎng)基,加入200 μL 4%多聚甲醛孵育15 min。孵育結束后棄去多聚甲醛,加入200 μL質量濃度為5 μg·mL-1的Hoechst33342染料,37 ℃避光孵育30 min后置于熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

采用流式細胞術檢測EEPC與PC3-Ⅲ處理后SMMC-7721細胞凋亡情況。將SMMC-7712接種到6孔板中(2 mL,2.5×105mL-1),按照細胞凋亡檢測試劑盒使用說明書操作。

采用劃痕實驗考查EEPC與PC3-Ⅲ對SMMC-7721細胞遷移作用的影響,將SMMC-7712接種于12孔培養(yǎng)板(1 mL,1.5×105mL-1),長滿后用槍頭劃痕,隨后給藥并在0、24、48 h于倒置顯微鏡下(低倍鏡)拍照,最后用Image J軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

將樣品PC3-Ⅲ按照一定的濃度分別與正常的HSC-T6細胞及受到TGF-β激活的HSC-T6共同孵育,按照2.3中所述方法研究PC3-Ⅲ樣品對HSC-T6激活后的體外增殖(MTT法)的影響,并將結果和EEPC樣品進行對比。

2.6 土鱉蟲活性蛋白PC3-Ⅲ的化學表征

使用BCA試劑盒對PC3-Ⅲ進行含量測定。使用分離膠濃度為12%的預制膠對樣品PC3-Ⅲ進行SDS-PAGE分析。

利用Waters e2695高效液相色譜儀及漢邦MEGRESS C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)柱對PC3-Ⅲ進行HPLC分析。洗脫溶劑系統(tǒng)是水-三氟乙酸(TFA)(溶劑A 100∶0.1,v/v)和乙腈(溶劑B)。0～30 min,溶劑B從0～20%進行梯度洗脫,流速1 mL·min-1;柱溫:30 ℃;檢測波長:280 nm。

利用LC-MS/MS對PC3-Ⅲ的鑒定由上海中科新生命分析服務部進行。PC3-Ⅲ經(jīng)過還原和烷基化處理后,加入Trypsin(質量比1∶50),在37 ℃條件下酶解20 h。酶解產(chǎn)物脫鹽后凍干,復溶于0.1%甲酸溶液中,-20 ℃保存待用。采用納升流速的HPLC液相系統(tǒng)Easy-nLC進行分離。緩沖液A液為0.1%甲酸水溶液,B液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為84%)。色譜柱以95%的A液平衡,樣品由自動進樣器上樣到上樣柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap100,100 μm×2 cm,nanoViper C18),經(jīng)過分析柱(Thermo scientific EASY column,10 cm×75 μm,3 μm,C18-A2)分離,流速為300 nL·min-1。0～50 min,B液線性梯度從0～60%;50～54 min,B液線性梯度從60%～90%;54～60 min,B液維持在90%。樣品經(jīng)色譜分離后用Q-Exactive質譜儀進行質譜分析。檢測方式為正離子,母離子掃描范圍m/z300～1 800,一級質譜分辨率為70 000(m/z200),最大增益控制(AGC Target)為1×106,一級最大進樣時間(Maximum IT)為40 ms,掃描范圍數(shù)(Number of scan ranges)為1,動態(tài)排除(Dynamic exclusion)為30.0 s。多肽和多肽碎片的質量電荷比按照下列方法采集:每次全掃描(Full scan)后采集20個碎片圖譜(MS2 scan),MS2解離模式(MS2 Activation type)為高能碰撞解離(HCD),隔離窗口(Isolation window)為m/z2,二級質譜分辨率17 500(m/z200),微碎片圖譜數(shù)(Microscans)為1,二級Maximum IT為50 ms,歸一化碰撞能量(Normalized collision energy)為27 eV,填充率(Underfill ratio)為0.1%。質譜測試原始文件(Raw file)用Mascot2.2軟件檢索相應的數(shù)據(jù)庫(uniprot_Corydiidae_385_20220425),搜庫條件:Enzyme為Trypsin,固定修飾(Fixed modifications)選擇為Carbamidomethyl(C)修飾,不完全酶解位點數(shù)(Missed cleavages)為2個,物種來源(Taxonomy)為鱉蠊科(Corydiidae),肽質量誤差(Mass tolerance)為0.1 Da,肽段篩選的最低分為20。經(jīng)檢索后得到鑒定結果。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

3 結果

3.1 土鱉蟲的提取分離與粗蛋白產(chǎn)物制備

65.19 g EE鹽析后得到27.59 g粗蛋白EEP,得率為18.47%。EEP為無氣味黃褐色絮狀物質。12.21 g EEP復溶后經(jīng)超濾分離得到1.28 g EEPA,1.71 g EEPB和8.50 g EEPC,得率分別為10.79%、12.50%、72.32%。EEPA、EEPB、EEPC均為絮狀物質,顏色由淺到深,分別為淡黃色、黃色和黃褐色。

3.2 土鱉蟲蛋白分離物對SMMC-7721細胞增殖影響

從圖1中可以看出,在0～2 mg·mL-1的濃度范圍之內(nèi),5種土鱉蟲產(chǎn)物EE、EEP、EEPA、EEPB及EEPC均對正常肝細胞無毒,因此后續(xù)實驗濃度選在此范圍內(nèi)。EE、EEP、EEPA、EEPB及EEPC均能以濃度依賴性方式抑制肝腫瘤細胞SMMC-7721的增殖。EE、EEPA對SMMC-7721的IC50值分別>2 mg·mL-1、>1 mg·mL-1;EEP、EEPB及EEPC對SMMC-7721的IC50值分別為1、0.93、0.67 mg·mL-1。EE的IC50值大于EEP,說明經(jīng)鹽析分離得到的粗蛋白樣品EEP是土鱉蟲主要的抗腫瘤活性成分。而EEP經(jīng)超濾分離得到的3個樣品中,分子量最大的EEPC具有更強的抗SMMC-7721增殖作用,說明EEPC在體外具有潛在的抗肝癌作用。

注:與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3.3 土鱉蟲蛋白分離物對活化的HSC-T6細胞增殖的影響

從圖2中可以看出,在0～2 mg·mL-1的濃度范圍之內(nèi),5種土鱉蟲產(chǎn)物EE、EEP、EEPA、EEPB及EEPC均對正常HSC-T6細胞無毒性作用,因此后續(xù)實驗濃度在此范圍內(nèi)。與空白對照組相比,模型對照組加入TGF-β后顯著刺激了HSC-T6細胞的生長(P<0.01),說明造模成功。與模型對照組相比,EE、EEP、EEPA、EEPB及EEPC都一定程度上抑制了激活后HSC-T6細胞活力。樣品EE及EEP考察濃度范圍為0～2 mg·mL-1,樣品EEPA、EEPB及EEPC作用濃度范圍為0～1 mg·mL-1。EE在考察濃度范圍內(nèi)對HSC-T6細胞活力無顯著性影響,EEP能顯著抑制活化HSC-T6細胞生長(P<0.05,P<0.01),且具有一定的濃度依賴性。說明經(jīng)鹽析分離得到的粗蛋白樣品EEP是土鱉蟲主要的抑制纖維化活性成分。樣品EEP的分離物EEPA、EEPB及EEPC各濃度組都能顯著抑制激活后HSC-T6細胞生長(P<0.05,P<0.01),而其中活性最強的是EEPC樣品。由此可見EEP及EEPC可延緩肝纖維化的形成,并且EEPC是EEP發(fā)揮抑制肝纖維化進程的主要活性部位。

注:與模型對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3.4 土鱉蟲活性蛋白PC3-Ⅲ的分離純化

將活性強的EEPC進行下一步純化。經(jīng)DEAE陰離子層析將其分為6個組分(圖3A),分別命名為PC1～6。收集其豐量組分PC3(圖3B),經(jīng)Sephadex G-100層析后,分為3個組分(圖3C),分別命名為PC3-Ⅰ～Ⅲ,收集其豐量組分PC3-Ⅲ(圖3D)并冷凍干燥,最終得到蛋白PC3-Ⅲ。

注:A.EEPC陰離子交換色譜洗脫曲線;B.EEPC經(jīng)DEAE洗脫所得6組分峰面積定量分析; C.PC3凝膠過濾色譜洗脫曲線;D.PC3經(jīng)Sephadex G-100洗脫所得3組分峰面積定量分析

3.5 PC3-Ⅲ對SMMC-7721細胞增殖的影響

PC3-Ⅲ是EEPC的主要成分,為了研究PC3-Ⅲ是否對肝癌細胞具有抗增殖作用,MTT法檢測了PC3-Ⅲ處理后SMMC-7721的細胞活力。如圖4所示,PC3-Ⅲ在0～2 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)對正常肝細胞L-02無毒。PC3-Ⅲ在0～1 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)都能顯著抑制腫瘤細胞SMMC-7721的增殖(P<0.01)，IC50值為0.88 mg·mL-1。說明PC3-Ⅲ在體外具有潛在的抗肝癌作用,并且是EEPC的主要活性部位。

注:與空白對照組比較,**P<0.01。

3.6 EEPC與PC3-Ⅲ誘導SMMC-7721細胞凋亡

如圖5所示,空白對照組細胞核染色均勻,不同濃度EEPC及PC3-Ⅲ給藥組細胞核固縮,染色質凝聚,并有凋亡小體形成和熒光強度增強。說明EEPC及PC3-Ⅲ能夠誘導SMMC-7721細胞的凋亡。如圖6所示,與空白對照組相比,不同濃度EEPC及PC3-Ⅲ處理SMMC-7721細胞后,細胞的凋亡比例明顯增高(P<0.05,P<0.01),且呈濃度依賴性。說明了EEPC及PC3-Ⅲ是通過誘導SMMC-7721細胞凋亡來抑制其惡性增殖,從而發(fā)揮抗腫瘤活性。

圖5 EEPC及PC3-Ⅲ誘導SMMC-7721細胞凋亡的形態(tài)學變化

注：與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3.7 EEPC與PC3-Ⅲ抑制SMMC-7721細胞遷移

采用劃痕試驗觀察EEPC與PC3-Ⅲ對SMMC-7721遷移的影響。空白對照組細胞在48 h后遷移填充劃痕區(qū)域,而EEPC與PC3-Ⅲ在0.25、0.5、1 mg·mL-1濃度下均顯著抑制SMMC-7721的遷移。說明EEPC及PC3-Ⅲ也能通過抑制腫瘤細胞遷移來發(fā)揮抗肝癌作用(圖7)。

圖7 EEPC及PC3-Ⅲ處理不同時間后SMMC-7721細胞遷移情況

3.8 PC3-Ⅲ對活化的HSC-T6細胞增殖的影響

通過考察PC3-Ⅲ在體外對活化的HSC-T6細胞增殖影響來判斷其體外抑制肝纖維化的作用。如圖8所示，在0～2 mg·mL-1的濃度范圍之內(nèi),PC3-Ⅲ對正常HSC-T6細胞無毒,因此后續(xù)實驗濃度選在此范圍內(nèi)。PC3-Ⅲ在不同濃度下均能顯著抑制TGF-β激活后的HSC-T6細胞增殖(P<0.01),且具有劑量依賴性。表明PC3-Ⅲ具有延緩肝纖維化進程的作用,是EEPC中發(fā)揮延緩肝纖維化進程的主要成分。

注:與模型對照組比較,**P<0.01。

3.9 PC3-Ⅲ蛋白的表征

EEPC里面的主要活性成分為PC3-Ⅲ,其得率為71.89%,因此對其進行了部分理化表征。BCA試劑盒法測得PC3-Ⅲ的蛋白含量為(96.48±2.64)%。RP-HPLC的結果(圖9A)顯示1個純度超過97%的對稱峰,表明PC3-Ⅲ是均一蛋白;PC3-Ⅲ在SDS-PAGE中出現(xiàn)單條帶(圖9B),分子量約為10 kDa。我們采用LC-MS/MS(nanoLC-QE)技術對PC3-Ⅲ進行定性分析,然而由于其基因組序列未知,我們無法知道PC3-Ⅲ的確切序列[21],盡管如此,依然對在MS分析中顯示出的高信號強度肽進行了測序,使用Mascot2.2軟件檢索相應的數(shù)據(jù)庫,查庫得到的3個肽段的序列分別為QYSINFISAR、CNGDSCVCTFR和SNNFR(表1),結果顯示PC3-Ⅲ對同源蛋白A0A0M3STY1(https://www.uniprot.org/uploadlists/)的覆蓋率達到35%,圖9C為其二級質譜圖。

表1 由Q-Exactive質譜儀鑒定的PC3-Ⅲ肽片段的信息

注:A.RP-HPLC分析;B.SDS-PAGE分析;C.QE序列分析二級質譜圖

4 討論

本文基于抑制肝異常細胞增殖的細胞評價技術來篩選土鱉蟲中的活性成分。利用肝癌細胞SMMC-7721考察樣品EE、EEP、EEPA、EEPB、EEPC在體外抗肝癌活性。采用細胞因子TGF-β激活HSC-T6細胞考察樣品EE、EEP、EEPA、EEPB、EEPC在體外抑制肝纖維化的作用。目前認為大鼠肝星狀細胞的活化和增殖是導致肝纖維化的關鍵過程。在正常情況下,肝星狀細胞處于靜止狀態(tài),不表達α平滑肌肌動蛋白(α-SMA),增殖活性低；當它激活后,通過增殖和分泌細胞外基質參與肝纖維化的形成。肝纖維化是肝星狀細胞激活和隨后過量的細胞外基質(ECM)沉積的結果[22]。

篩選得到活性蛋白部位EEPC及活性蛋白成分PC3-Ⅲ,體外細胞實驗表明它們具有體外抗肝癌及延緩肝纖維化進程的活性。腫瘤生長和轉移是大多數(shù)癌癥患者死亡的原因。腫瘤轉移是一個復雜的過程,腫瘤細胞遷移和侵襲是2個關鍵步驟[23]。而EEPC及PC3-Ⅲ通過抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞遷移來抑制腫瘤的生長和轉移，從而發(fā)揮抗肝癌藥效。EEPC及PC3-Ⅲ能通過抑制活化的HSC-T6細胞增殖來延緩肝纖維化的進程?；钚缘鞍壮煞諴C3-Ⅲ的理化性質和結構分析通過電泳、HPLC及LC-MS/MS得到揭示。

總體而言,EEPC及PC3-Ⅲ具有潛在的抗肝癌及延緩肝纖維化病變的應用開發(fā)價值,值得進一步深入研究。