孫繼超,張碧霞,李偉偉

(廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023)

注意缺陷多動障礙(Attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)是兒童常見的神經發(fā)育障礙性疾病,其核心癥狀表現為與年齡不相稱的注意力不集中、多動和沖動行為,全球患病率為6%～8%[1]。目前ADHD發(fā)病機制尚不明確,研究認為該病是由遺傳與環(huán)境共同作用導致的,其中針對分子遺傳學的相關研究,尤其是有關“多巴胺系統(tǒng)缺陷”假說是研究的熱點[2]。

滋腎瀉青湯是遵從錢乙“五臟辨證”理論中“補虛瀉實”的原則組方,由熟地黃、山萸肉、白芍、丹皮、何首烏、杜仲、龍膽草、柴胡、石菖蒲、甘草組成,具有益腎填精、疏肝瀉火、安神定志的功效,適用于ADHD證屬肝腎陰虛的患兒。方中熟地黃填精益髓，滋陰補腎,為本方之君藥。山萸肉滋補肝腎，補血固精,何首烏補益精血,杜仲補肝腎,柴胡為“肝膽之要藥”,味苦微寒,疏肝解郁,共為臣藥。白芍柔肝斂陰，平抑肝陽,丹皮清瀉虛熱兼緩山萸肉溫澀之藥性,龍膽草瀉肝膽之火,石菖蒲開竅豁痰，醒神益智共為佐藥,甘草調和諸藥為使。諸藥配伍,補中有瀉,瀉中寓補,補瀉兼施,補大于瀉,可補肝腎之陰,兼顧清瀉“風”“火”“痰”等病理產物[3]。

臨床研究表明滋腎瀉青湯治療ADHD有較好的療效[3],為進一步闡明滋腎瀉青湯方治療ADHD的作用機制,本實驗擬基于模型動物前額葉的多巴胺受體脫敏-復敏信號通路進行相關研究,以期為后期該方的進一步推廣提供參考。

1 材料

1.1 動物

3周齡SPF級雄性WKY大鼠10只,SHR大鼠50只,體質量(62～75)g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2016-0011。大鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學動物實驗中心,自由飲食進水,正式實驗前適應性飼養(yǎng)5 d。實驗經過廣西中醫(yī)藥大學倫理委員會審核，倫理編號：20180310。

1.2 藥物

滋腎瀉青湯方由熟地黃15 g，山萸肉10 g，白芍15 g，丹皮10 g，何首烏10 g，杜仲10 g，龍膽草5 g，柴胡10 g，石菖蒲10 g，甘草6 g組成,藥材同批次購自廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。將藥液濃縮至0.41、0.80、1.61 g·mL-1,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利他林片(10 mg·片-1,批號:210619,蘇州第一制藥有限公司)。加雙蒸水溶解成0.067 g·L-1的混合液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要儀器

pH酸度儀、精密天平(德國Sartorius公司);ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)、Trans-Blot SD半干轉印儀、電泳槽(美國Bio Rad公司);M200 pro酶標儀(瑞士Tecan公司);Light Cycle型DNA熒光定量分析儀(德國Roche公司);Quantsdudio7熒光PCR儀(美國Life公司)等。開場試驗、水迷宮等行為學設備購自北京碩林苑科技有限公司,設備規(guī)格:開場實驗箱(100 cm×100 cm×40 cm),溫控水迷宮池(150 cm×50 cm),設備均經黑色噴漆處理。通用小動物軌跡分析系統(tǒng)(SLY-ETS Version 1.66)。

1.4 主要試劑

β-actin多克隆抗體(美國Santa cruz，批號:sc-47778);Anti-GRK-6抗體、Anti-β-arrestin2抗體、Anti-NCS-1抗體、Anti-PSD-95抗體、Anti-PP2A抗體(美國Abcam公司,批號：ab106673、ab167047、ab129166、ab18258、ab32141)；羊抗兔二抗(美國Abcam,批號：ab6271);BCA試劑盒、ECL化學發(fā)光底物(美國Thermo,貨號：23227、32109);逆轉錄試劑盒、Trizol、RT-PCR試劑盒(日本TAKARA,貨號：9109、RR036A、RR820A)；PCR吸頭和離心管均為一次性無RNA酶產品,氯仿等其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 動物分組及處理

將10只WKY大鼠設為正常對照組,按數字表法將50只SHR大鼠隨機分為5組:模型組，利他林組，滋腎瀉青湯低、中、高劑量組,每組10只。服藥量根據9歲(體質量26 kg)兒童體表面積和4周齡(體質量60 g)SHR幼鼠體表面積進行換算[4]。正常對照組、模型組均以雙蒸水0.015 mL·g-1灌胃,滋腎瀉青湯低、中、高劑量組分別以對應中藥溶液0.015 mL·g-1灌胃,合生藥量利他林組2 mg·kg-1，滋腎瀉青湯低劑量組、中劑量組、高劑量組6.0、12.1、24.1 g·kg-1,每日2次,持續(xù)4周。

2.2 行為學檢測

當天首次給藥1 h后開始,在第2次灌胃前結束行為學測試,檢測過程中保持外界環(huán)境一致。實驗方法參照課題組前期實驗方法[5]。

開場實驗:分別在給藥前及給藥后2、4 周進行。將大鼠置于開場實驗箱中央區(qū)域,系統(tǒng)自動記錄大鼠5 min內的總運動距離(m),攝像頭跟蹤描繪動物運動軌跡。

Morris水迷宮:在治療3周時進行。實驗連續(xù)進行6 d,第1～5天進行隱蔽站臺實驗,第6天進行空間探索實驗。統(tǒng)計各組大鼠第1～5天的潛伏期時間及第6天潛伏期的數據。

2.3 樣本處理

末次給藥后次日處死大鼠,冰臺上分離大腦前額葉組織,保存在液氮中,后轉移至超低溫冰箱備用。

2.4 Western blot法

蛋白提取、制膠及計算方法同前[6]。一抗?jié)舛确謩e為:兔源GRK-6一抗(1∶1 000)、兔源β-arrestin2一抗(1∶1 000)、兔源NCS-1一抗(1∶2 000)、兔源PSD-95一抗(1∶500)、兔源PP2A一抗(1∶5 000)。

2.5 引物設計

根據Gen-Bank設計引物,由生工生物工程有限公司完成,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參,序列參見表1。

表1 引物序列

2.6 實時定量PCR法

腦組織提取RNA步驟及計算方法同前[6]。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 滋腎瀉青湯對SHR大鼠開場實驗運動距離的影響

結果如表2所示,與正常組相比,SHR大鼠在開場實驗中的活動距離顯著增加(P<0.01);經藥物干預后,與模型組對比,利他林組及中藥干預組的活動距離有所減少,其中滋腎瀉青湯各劑量組均可減少SHR大鼠的開場實驗運動距離(P<0.05，P<0.01)。

表2 滋腎瀉青湯對SHR大鼠開場實驗活動距離的影響

3.2 滋腎瀉青湯對SHR大鼠水迷宮隱蔽站臺實驗潛伏期的影響

結果如表3所示,與正常組相比,SHR大鼠在水迷宮隱蔽站臺實驗潛伏期的時間明顯減少(P<0.01);經藥物干預后,與模型組對比,利他林組及中藥干預組大鼠在水迷宮隱蔽站臺實驗潛伏期的時間有減少趨勢或顯著減少(P<0.05，P<0.01)。

表3 滋腎瀉青湯對SHR大鼠水迷宮隱蔽站臺實驗潛伏期的影響

3.3 滋腎瀉青湯方對大鼠前額葉多巴胺受體脫敏-復敏信號通路相關蛋白表達的影響

與正常組相比,模型組PP2A蛋白有下降趨勢,無統(tǒng)計學差異,β-arrestin2、NCS-1、PSD-95蛋白表達明顯降低(P<0.05),而GRK-6的蛋白表達明顯增加(P<0.05);治療后,相比模型組,利他林組和滋腎瀉青湯治療組有上調β-arrestin2、NCS-1、PSD-95、PP2A蛋白表達的趨勢或能顯著提高上述蛋白的表達(P<0.05),同時有下調GRK-6蛋白表達的趨勢或顯著下調GRK-6的蛋白表達(P<0.05)。見圖1。

注: WKY+DDW.正常對照組;SHR+DDW.模型組;SHR+MPH. 利他林組;SHR+ZXT-L、M、H.滋腎瀉青湯低、中、高劑量組。與WKY+DDW組比較,*P<0.05;與SHR+DDW組比較,

3.4 滋腎瀉青湯方對大鼠前額葉多巴胺受體脫敏-復敏信號通路相關因子mRNA表達的影響

與正常組相比,模型組PP2A的mRNA表達有下調趨勢,β-arrestin2、NCS-1、PSD-95 mRNA表達明顯降低(P<0.05),GRK-6的mRNA表達明顯增加(P<0.05);治療后,與模型組相比,利他林組和滋腎瀉青湯治療組有上調β-arrestin2、PSD-95、NCS-1、PP2A mRNA的表達趨勢或能顯著提高上述mRNA的表達(P<0.05),有下調GRK-6的mRNA表達的趨勢或能顯著下調其表達(P<0.05),且以利他林組和滋腎瀉青湯高劑量組療效為佳,見圖2。

注:WKY+DDW.正常對照組;SHR+DDW.模型組; SHR+MPH.利他林組;SHR+ZXT-L、M、H.滋腎瀉青湯低、中、高劑量組。 與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,

4 討論

ADHD患兒在學齡期往往存在學習困難、人際關系不佳等問題,若不經正規(guī)持續(xù)合理的治療,癥狀可能會持續(xù)終身,導致成年后職業(yè)成就低,社會功能受到損害。循證醫(yī)學結果表明,經過正確診斷及合理治療,該病往往可以取得較好的治療效果,從而改善學業(yè)、工作、社會功能等諸多問題。盡管目前ADHD的發(fā)病機制不明,但多巴胺系統(tǒng)功能的缺陷,特別是其對前額葉-紋狀體環(huán)路的調控異常,被認為與ADHD的發(fā)病密切相關[7-9]。而前額葉皮質的神經功能與ADHD癥狀表現密切相關,包括注意力集中、工作記憶和執(zhí)行功能等,故本實驗將前額葉皮質作為研究部位,探討復方滋腎瀉青湯治療ADHD的潛在作用機制。

本實驗重點研究滋腎瀉青湯對SHR大鼠行為學及前額葉皮質多巴胺受體脫敏-復敏信號通路的影響。脫敏即受體對激動劑刺激做出不反應或反應減低,包括同源性脫敏及異源性脫敏。同源性脫敏指激動劑引起的G蛋白偶聯受體與其相應G蛋白的解偶聯,因此使G蛋白偶聯受體失活,其過程與G蛋白偶聯受體激酶(GPCR kinase, GRK)、β-arrestins磷酸化受體密切相關[10-12];異源性脫敏指與該受體激動劑無關的脫敏,即該受體并未受到其選擇性激動劑刺激的情況下出現脫敏,其與細胞第二信使系統(tǒng)激酶的激活關系密切,如多巴胺D1受體是蛋白激酶A(Protein kinase A, PKA)的磷酸化位點[13-14];有研究表明神經元鈣感應蛋白(Neuronal calcium sensor-1,NCS-1)與D2受體脫敏機制存在關聯[15]。復敏指的是受體內吞后被細胞內的磷酸酶去磷酸化,并被重新回收到膜上繼續(xù)行使其功能的過程,這一過程與細胞內的磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A,PP2A)的功能相關[16];除了上述機制,新的研究表明突觸后致密物-95(Postsynaptic density-95,PSD-95)可提高多巴胺受體的復敏[17-18],說明多巴胺受體的表達受到脫敏、復敏雙向機制的調控。綜上,上述信號通路任何環(huán)節(jié)的異常均可通過脫敏-復敏的狀態(tài)影響多巴胺受體的功能。

實驗結果提示利他林及滋腎瀉青湯能改善大鼠行為學的表現,減少其多動表現;并能影響SHR大鼠前額葉皮質中多巴胺受體脫敏-復敏信號通路中相關調控因子的表達。與正常組相比,模型組中β-arrestin2、NCS-1、PSD-95和PP2A的蛋白及mRNA相關表達呈下調趨勢,而GRK-6的相關表達則被上調。說明較正常組,模型組多巴胺受體影響復敏的相關因子表達減弱,而影響脫敏的相關因子有增強表達,提示脫敏發(fā)揮的效應可能強于復敏,從而影響了多巴胺受體的功能。經藥物干預后,藥物組能上調大鼠前額葉皮質中β-arrestin2、NCS-1、PSD-95和PP2A相關表達的同時能下調GRK-6的表達,提示藥物有增強受體復敏、減少脫敏的干預作用。綜合分析實驗結果后,推測滋腎瀉青湯作用機制可能與抑制多巴胺受體脫敏、促進復敏有關,進而影響多巴胺受體的功能,達到改善行為學表現的目的。