劉歡歡,張婷,王敏,于銀萍,蘇聯(lián)麟,季德,陸兔林,李林

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標準化工程研究中心,江蘇 南京 210023)

當歸為傘形科植物當歸AngeliaSinensis(Oliv.) Diels的干燥根,味甘,性溫,歸心、肝、脾經(jīng)，具有補血活血、祛瘀生新的功效,被醫(yī)家譽為“婦科要藥”。《中國藥典》2020年版主要利用其中的阿魏酸和揮發(fā)油含量測定對其進行質(zhì)量評價[1],而當歸單一化學(xué)成分的含量高低并不能直接指征當歸飲片補血活血的藥效優(yōu)劣,因此該方法不能完全反映當歸質(zhì)量[2-4]。

目前,中藥及其飲片多以有限個成分的定性、定量分析來控制其質(zhì)量優(yōu)劣,部分品種甚至沒有含量測定項,因此化學(xué)測定不能有效表征其藥效水平,較難滿足現(xiàn)代中醫(yī)藥的發(fā)展需求。如常用消食藥雞內(nèi)金,《中國藥典》2020年版對其質(zhì)量評價僅限于性狀、檢查等常規(guī)的理化檢測[1],與其關(guān)鍵生物活性相關(guān)性不高,難以準確反映其臨床功效。黃偉等[5]建立了一種基于胃蛋白酶活性的雞內(nèi)金促消食效價測定法,能夠直觀反映雞內(nèi)金消食化積的臨床功效,也為神曲、麥芽等消食類中藥質(zhì)量控制提供參考。因此,為更好保障中藥飲片臨床使用的安全有效,有必要在現(xiàn)有化學(xué)測定的基礎(chǔ)上增加生物活性測定,以綜合評價其質(zhì)量。

諸多研究顯示,當歸具有補血功效,主治血虛之癥,可以有效改善貧血,其作用機制主要是促進造血祖細胞增殖,提高血紅蛋白水平[6-10]。本實驗擬結(jié)合血紅蛋白檢測技術(shù),從補血活性層面探索建立當歸飲片生物效價方法,從而在化學(xué)測定的基礎(chǔ)上補充藥效檢定,以期完善當歸現(xiàn)行質(zhì)量標準體系,并為其他補血類中藥生物活性測定及其質(zhì)量控制提供新思路[11-13]。

1 材料

1.1 儀器

INC0108型二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Memmert);Synergy H1型多功能酶標儀(美國Biotek);FA1104N型電子天平(上海菁海儀器有限公司);Eclipse 80i型倒置顯微鏡(上海衡浩儀器有限公司)。

1.2 試劑

人類髓性白血病K562細胞、RPMI 1640細胞培養(yǎng)基(南京貝佳生物科技有限公司);胎牛血清(上海李記生物科技有限公司);CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);二甲基亞砜(DMSO,南京翼飛雪生物科技有限公司);氯化血紅素(Hemin,上海源葉生物科技有限公司,5 g·瓶-1,純度98%);過氧化氫(H2O2,國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號:20160325,純度30%);乙酸(上海申博化工有限公司,批號:1801101)。

1.3 藥材與飲片

1～15號當歸飲片購自甘肅、河北等不同地區(qū)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定,均為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels干燥根的加工品。分別取批號為1804002、18010261、20180101的3批生當歸飲片,按照《中國藥典》2020年版收載的炮制工藝加工制備得到酒當歸飲片[14],按照《甘肅省中藏藥材炮制規(guī)范》收載的炮制方法制備得到土炒當歸飲片[15],編為16～21號。分別取批號為2018-03-09、2018-03-20、2018-03-08的3批當歸藥材,加工制備得到當歸頭、當歸身、當歸須飲片,編為22～30號(表1)。

表1 當歸飲片樣品采集情況表

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取100 g當歸飲片樣品,加入8倍量水,浸泡30 min后煎煮3次,每次3 h,合并煎液并濃縮至相同體積,凍干后即為當歸飲片提取物。干燥提取物用RPMI 1640培養(yǎng)基溶解,制成供試品溶液,置冰箱冷藏室(0～4 ℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 標準品溶液的制備

取65.2 mg Hemin,以10 mL的RPMI 1640培養(yǎng)基溶解,所得Hemin溶液質(zhì)量濃度為1×104μmol·L-1,實驗中稀釋至相應(yīng)工作濃度,作為本方法的標準品。

2.3 聯(lián)苯胺染液的制備

分別配制0.5%、10%的乙酸溶液和1%的H2O2溶液,取聯(lián)苯胺20 mg,用10 mL的0.5%乙酸溶液溶解,得到質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的聯(lián)苯胺溶液。

2.4 細胞培養(yǎng)

選用人類髓性白血病K562細胞系,使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng),每2～3 d傳代1次,取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.5 加藥培養(yǎng)與檢測

調(diào)整細胞濃度并接種于6孔細胞培養(yǎng)板,24 h后加藥培養(yǎng);取樣品溶液,以0.5劑距配置多個劑量組,按照表2加入對應(yīng)藥物并充分混勻,共培養(yǎng)4 d。為維持細胞生長和分化所必要的營養(yǎng),每2.5 d換液1次。反應(yīng)完成后,按照1 000 r·min-1離心10 min收集細胞,每組加入60 μL聯(lián)苯胺溶液和60 μL的H2O2溶液,避光反應(yīng)30 min,加入600 μL的10%乙酸溶液,混勻后于570 nm處測定吸光值(ABS)。每組平行3孔,每孔重復(fù)測定2次,取其平均值。血紅蛋白含量(相對值)按照公式(1)計算:

(1)

表2 加樣方法與加樣量

2.6 供試品濃度選擇和效價測定

實驗前期,對Hemin和當歸飲片提取物進行大范圍的濃度篩選,分析得到標準品和供試品不同濃度對血紅蛋白含量(相對值)的影響,選擇效應(yīng)顯著且量效相關(guān)的濃度范圍,在此范圍內(nèi)探究并計算當歸飲片補血效價。

本實驗以Hemin為標準品,設(shè)定供試品當歸飲片估示效價A為100 U·mg-1。按照生物檢定量反應(yīng)平行線測定法進行實驗設(shè)計,標準品組設(shè)置高、中、低3個劑量組ds1、ds2、ds3分別為0.326、0.652、1.304 U·mL-1，實驗組設(shè)置高、中、低3個劑量組dt1、dt2、dt3分別為0.024、0.048、0.096 U·mL-1(表3),操作步驟同2.5項下。分析方法參考《中國藥典》2020年版附錄1431生物檢定統(tǒng)計法[16],按照公式(2)進行計算。

(2)

注：常數(shù)2.51是效價計算所需數(shù)值,根據(jù)《中國藥典》2020年版所收載的1431生物檢定統(tǒng)計法,本研究選用量反應(yīng)平行線測定法,設(shè)置高低劑量比為1∶0.5,由此確定效價計算所需數(shù)值為2.51。

表3 檢測結(jié)果表

3 結(jié)果

3.1 當歸補血活性檢測和量效關(guān)系考察

標準品Hemin和當歸樣品的量效曲線圖形狀基本一致,低濃度時無明顯促進血紅蛋白生成作用,隨著樣品濃度增高，促進作用增強,但高濃度時由于藥物產(chǎn)生毒性作用導(dǎo)致血紅蛋白生成量減少。如圖1所示,量效曲線圖基本符合“S”曲線趨勢,提示當歸與Hemin的補血作用趨勢在一定范圍內(nèi)基本相同。

圖1 Hemin(A)和當歸飲片(B)補血活性量效曲線圖

3.2 線性關(guān)系考察

分別以標準品Hemin和當歸樣品對數(shù)劑量考察線性關(guān)系,結(jié)果如下:Hemin線性方程為:y=0.332 6lnx+0.511 0,R2=0.991 4,在5.18～40.00 μmol·L-1范圍內(nèi)顯示良好的線性關(guān)系(圖2A);當歸樣品飲片線性方程為:y=0.452 9lnx+1.744 5,R2=0.990 7,在0.39～3.00 μg·mL-1范圍內(nèi)顯示良好的線性關(guān)系(圖2B)。說明此反應(yīng)類型在一定范圍內(nèi)適用生物檢定中的量反應(yīng)平行線測定法進行效價測定。

圖2 Hemin(A)和當歸飲片(B)補血活性線性考察

3.3 效價計算

3.3.1 可靠性檢驗 當歸樣品可靠性檢驗結(jié)果分析:試品間差異不顯著(P>0.05),說明供試品和標準品效價無明顯差別;回歸項差異顯著(P<0.01),說明隨著樣品質(zhì)量濃度的降低,血紅蛋白含量(相對值)有規(guī)律地降低;偏離平行線差異無顯著意義(P>0.05),說明供試品和標準品呈平行直線關(guān)系(表4)。綜上所述,所測結(jié)果有效。

表4 當歸樣品生物效價(3·3)法可靠性測驗結(jié)果

3.3.2 效價與可信限 根據(jù)《中國藥典》2020年版所載的量反應(yīng)平行線測定法,結(jié)合表3與公式2所示進行計算,得到當歸樣品測得效價PT=1 358.37 U·mg-1,效價可信限率FL=6.37%,即表示該樣品效價在1 285.625～1 458.766 U·mg-1范圍內(nèi)是可信的。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 精密度 取相同質(zhì)量濃度的當歸樣品的供試品溶液6份,檢測得到血紅蛋白含量(相對值)分別為110.57%、111.26%、109.48%、112.96%、112.47%、111.35%,RSD值為1.26%,表明儀器精密度良好。

3.4.2 重復(fù)性 取當歸樣品的干燥提取物5份,分別按照1.2項下的制備和檢測方法計算補血效價,5次結(jié)果分別為1 427.754、1 292.922、1 392.497、1 463.447、1 358.423 U·mg-1,RSD值為4.73%,表明該方法具有較好的重復(fù)性。

3.5 樣品檢測結(jié)果與分析

1～15號當歸飲片購自甘肅、河北等不同地區(qū)代表性企業(yè),測得效價差別明顯,表明該方法可以有效區(qū)分不同來源、不同批次的當歸飲片(圖3A)。13～15號生當歸飲片炮制得到16～18號酒當歸飲片以及19～21號土炒當歸飲片;測得13～21號當歸不同炮制飲片效價差別明顯,表明該方法可以對相同來源、不同炮制方法所得飲片進行區(qū)分。中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論認為生當歸質(zhì)潤,具有補血、調(diào)經(jīng)、潤腸通便的功能;酒當歸辛溫,有增強活血散瘀之功;土炒當歸苦溫,健脾和血，補血而不滑腸。本方法檢測結(jié)果顯示,不同炮制品的補血效應(yīng)排序為:生當歸>土炒當歸>酒當歸(圖3B),這與酒當歸主活血、土炒當歸溫和入藥的傳統(tǒng)理論是相符合的。22～30號當歸飲片分別為當歸頭、當歸身、當歸須各3批,以上當歸不同入藥部位測得效價差別明顯,表明該方法可以對相同來源、不同入藥部位進行區(qū)分;此外,本方法檢測結(jié)果顯示,不同入藥部位的補血效應(yīng)排序為:當歸身>當歸頭>當歸須(圖3C),這與“頭止血,身和血,梢破血”的傳統(tǒng)理論是相符合的。

4 討論

中藥的化學(xué)成分復(fù)雜、藥理作用廣泛,僅對少數(shù)成分進行質(zhì)控不能完全反映其質(zhì)量和臨床療效。在化學(xué)分析的基礎(chǔ)上增加生物活性測定,全面評價飲片質(zhì)量,是完善中藥質(zhì)量標準體系的有益補充,也是保證臨床用藥安全有效的重要方法。本文以當歸為研究對象,探索性地對其補血藥效相關(guān)的生物活性檢定方法進行研究。

K562細胞源于一位慢性髓系白血病患者的腹水,是此類疾病中第一個實現(xiàn)人工培養(yǎng)的細胞[17]。K562胞內(nèi)蛋白表達與紅系祖細胞相近,可誘導(dǎo)其定向紅系分化[18-20],相對于造血干細胞,該細胞不僅滿足體外研究紅系分化的需要,又具有易獲得易培養(yǎng)的優(yōu)勢,是本文體外補血活性測定方法的最優(yōu)選擇。紅系分化是指從造血干細胞到最終脫核釋放成熟紅細胞的過程,是當歸補血功效研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié),但存在分化周期較長、晚期細胞識別困難等問題;而血紅蛋白產(chǎn)生于紅系分化過程,其含量升降可體現(xiàn)紅細胞水平變化及其臨床意義[21]。研究表明,當歸補血的作用機制主要是促進造血干細胞增殖,提高血紅蛋白水平[22-24];而Hemin作為生物補鐵劑,可從外源大幅提高血紅蛋白合成原料,從而誘導(dǎo)K562細胞向紅系分化[25]。綜上,本研究結(jié)合血紅蛋白檢測技術(shù),以當歸飲片為供試品,以Hemin為標準品,從補血活性層面探索建立當歸飲片生物效價方法,以期量化當歸飲片的補血水平。

圖3 不同批次(A)、炮制方法(B)、入藥部位(C) 當歸飲片的補血效價

實驗表明,本方法的開發(fā)過程及結(jié)果均符合《中國藥典》2020年版所載的生物活性測定指導(dǎo)原則和生物檢定統(tǒng)計法的各項要求,將此方法應(yīng)用于不同來源、炮制方法、入藥部位的當歸飲片,可以得到穩(wěn)定可靠的補血效價。其中,生、土、酒當歸,當歸身、頭、尾的補血效價排序結(jié)果,也在一定程度上證明了傳統(tǒng)中醫(yī)用藥的科學(xué)性。綜上,本研究將與飲片功效高度相關(guān)的補血生物效價方法引入當歸飲片質(zhì)量評價中,從而改善了目前當歸及其他大多飲片的質(zhì)量控制方法依賴成分、忽視藥效的現(xiàn)狀。這為建立基于補血生物活性的當歸飲片質(zhì)量標準提供了試驗依據(jù),為進一步規(guī)范當歸飲片的炮制工藝和臨床應(yīng)用提供了理論指導(dǎo),同時也為完善其他補血類中藥的生物檢定和質(zhì)量標準提供了參考。