艾珊珊,崔濤,周樂,申振,李偉,韓聰

(1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,山東 濟(jì)寧 272067;2.濟(jì)南市章丘區(qū)中醫(yī)醫(yī)院腎病科,山東 濟(jì)南 250200;3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 濟(jì)南 250014;4.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 山東 濟(jì)南 250014)

糖尿病腎病(DKD)是由糖尿病(DM)引起的腎臟損傷,主要表現(xiàn)為蛋白尿、腎小球?yàn)V過率(eGFR)持續(xù)下降及微血管病變等[1]。臨床多采用降糖、降壓、飲食控制等常規(guī)治療,可適當(dāng)延緩疾病進(jìn)展,但仍有部分患者療效不甚明顯,因此積極尋求有效的防治策略,具有重要的臨床和社會(huì)意義。益腎化濕顆粒是一種廣泛應(yīng)用于治療慢性腎小球腎炎的中成藥,具有升陽補(bǔ)脾、益腎化濕、利水消腫的功效,多項(xiàng)臨床研究表明益腎化濕顆粒可改善DKD患者的癥狀,抑制炎癥反應(yīng),穩(wěn)定腎功能[2-5]。近年來關(guān)于“腸-腎軸”的研究揭示了腸道菌群可通過影響糖脂代謝、內(nèi)毒素積累、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等調(diào)節(jié)腎臟代謝進(jìn)而影響DKD進(jìn)程[6]。本團(tuán)隊(duì)的前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明益腎化濕顆粒能通過“腸-腎軸”調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu),降低腸道通透性,增加乳桿菌屬等益生菌含量,降低厭氧螺菌屬等條件致病菌含量,改善DKD大鼠糖脂代謝,減輕炎癥水平,保護(hù)腎功能[7]。基于此,本研究擬通過研究益腎化濕顆粒治療DKD的臨床療效及腸道菌群的變化,探討其通過“腸-腎軸”改善DKD的作用機(jī)制。

1 臨床資料

1.1 樣本量計(jì)算

使用臨床試驗(yàn)的樣本量計(jì)算公式:n=(uα+uβ)22p(1-p)/(p1-p0)2,查閱相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[3-5],p0代表西醫(yī)對(duì)癥治療后的達(dá)到療效約為60%,p1代表西醫(yī)對(duì)癥治療加用益腎化濕顆粒后達(dá)到的療效約為88%,計(jì)算出n≈42,即每組的樣本量為42,考慮到15%的脫失率,擬每組的樣本含量為42/(1-15%)≈50例。

1.2 一般資料

選取2020年11月至2021年8月于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科就診的DKD脾虛濕盛證患者100例,按隨機(jī)數(shù)字表法分為試驗(yàn)組及對(duì)照組,對(duì)結(jié)局評(píng)估者進(jìn)行設(shè)盲。試驗(yàn)組男31例,女19例;平均年齡(60.52±10.04)歲;平均收縮壓(127.26±8.23)mmHg;平均舒張壓(81.68±8.69)mmHg。對(duì)照組男27例,女23例;平均年齡(59.14±10.89)歲;平均收縮壓(128.82±7.89)mmHg;平均舒張壓(81.48±9.94)mmHg。2組患者一般資料、慢性腎臟病分期及尿蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào):KY2020-046)。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 符合《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》[8]與《CKD評(píng)估與管理臨床實(shí)踐指南,KDIGO,2012》[9]制定的DKD診斷標(biāo)準(zhǔn):有確診的糖尿病病史,根據(jù)尿蛋白肌酐比值(UACR)增高或腎小球?yàn)V過率(eGFR)下降、同時(shí)排除其他慢性腎臟病(CKD)。本研究選取患者分期為G1A1-G3aA3,參照2009年CKD流行病學(xué)協(xié)作組提出的CKD-EPI公式[10],G1-G3a即eGFR>45 mL·min·1·1.73 m-2,A1期:ACR<30 mg·g-1,A2期:ACR 30～300 mg·g-1,A3期:ACR>300 mg·g-1。

1.3.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[11]中脾虛濕盛證診斷標(biāo)準(zhǔn),主癥:顏面部或肢體浮腫,疲倦乏力,食少納呆,便溏;次癥:畏寒肢冷,腰脊酸痛;舌脈:舌淡胖嫩,舌苔白或白膩,脈沉細(xì)。具備主癥2項(xiàng)加次癥2項(xiàng),結(jié)合舌脈即可診斷。

1.4 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①年齡18～75歲;②符合CKD(G1A1-G3aA3期)及中醫(yī)脾虛濕盛證診斷標(biāo)準(zhǔn);③患者同意并簽署知情同意書。

1.4.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①其他繼發(fā)性腎臟疾病;②合并有嚴(yán)重的心腦血管等原發(fā)性疾病或影響生存的其他嚴(yán)重疾病;③妊娠或哺乳期婦女;④近1月接受抗生素或微生物治療;⑤正參與其他藥物臨床研究。

1.4.3 剔除及脫落標(biāo)準(zhǔn) ①出現(xiàn)過敏反應(yīng)或嚴(yán)重不良事件;②依從性差,未按要求服藥;③納入后資料不完全;④主動(dòng)退出研究。

2 方法

2.1 治療方法

對(duì)照組:予醫(yī)學(xué)營養(yǎng)治療、生活方式干預(yù)等一般治療。常規(guī)給與鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司,每片0.5 g)口服,每次0.25 g,每日3次;達(dá)格列凈片(阿斯利康制藥有限公司,每片5 mg)口服,每次5 mg,每日1次;纈沙坦膠囊(天大藥業(yè)有限公司,每粒80 mg)口服,每次80 mg,每日1次。

試驗(yàn)組:在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上加用益腎化濕顆粒(廣州康臣藥業(yè),每袋10 g),熱水沖服,每次10 g,每日3次。若血壓控制不佳可加用非ACEI/ARB類藥物,原有方案不再加量。

2組患者均連續(xù)治療8周。

2.2 觀察指標(biāo)及方法

2.2.1 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 采集患者治療前后空腹靜脈血各5 mL,肝素抗凝,3 000 r·min-1離心5 min后取血清,置-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測患者尿蛋白肌酐比值(UACR)、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1C)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、腎小球?yàn)V過率(eGFR)、白蛋白(ALB)、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素-6(IL-6)、尿N-乙酰-β氨基葡萄糖苷酶(NAG)水平或活性。以上委托山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。

2.2.2 中醫(yī)證候積分評(píng)估 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[11],記錄治療前后2組患者的中醫(yī)證候積分,主癥:顏面部或肢體浮腫,疲倦乏力,食少納呆,便溏,按輕、中、重分別記為2、4、6分;次癥:畏寒肢冷,腰脊酸痛按輕、中、重分別記為1、2、3分。積分越高,癥狀越嚴(yán)重。

2.2.3 臨床療效判定 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[11]擬定。顯效:①中醫(yī)證候積分減少≥60%;②UACR值減少≥40%;③FBG 控制在7.0 mmol·L-1以下;④SCr、BUN等指標(biāo)值均減少≥10%。有效:①中醫(yī)證候積分減少≥30%;②UACR值減少,但沒有達(dá)到顯效標(biāo)準(zhǔn);③FBG下降但未控制在7.0 mmol·L-1以下;④SCr、BUN等指標(biāo)減少未達(dá)顯效標(biāo)準(zhǔn)。無效:患者各項(xiàng)臨床癥狀均無改善或者惡化,UACR等指標(biāo)未下降甚至升高者。其中,①②③項(xiàng)為必備條件。

2.2.4 患者糞便16S rDNA V3+V4 區(qū)測序 治療8周后無菌隨機(jī)收集2組各30例患者糞便5 g至EP管,存于-80 ℃冰箱保存。提取患者糞便基因組 DNA,對(duì)16S V3+V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒構(gòu)建文庫,經(jīng)Qubit和Q-PCR定量檢測合格后使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測序。

2.2.5 安全性指標(biāo) 治療前后檢測患者血常規(guī)、大便常規(guī)、肝功能,監(jiān)測心電圖,觀察研究期間不良反應(yīng)的發(fā)生情況。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 2組患者治療前后中醫(yī)證候積分情況比較

結(jié)果見表1。

3.2 2組患者治療前后各生化指標(biāo)情況比較

結(jié)果見表2、表3。

3.3 2組患者臨床療效比較

結(jié)果見表4。

表1 2組患者治療前后中醫(yī)證候積分比較

表2 2組患者治療前后生化指標(biāo)情況比較[M(P25,P75), n=50]

表3 2組患者治療前后生化指標(biāo)比較

表4 2組患者臨床療效比較(n=50)

3.4 2組患者安全性檢測

2組患者均無不良反應(yīng)出現(xiàn),治療前后未出現(xiàn)血常規(guī)、大便常規(guī)、肝功能等指標(biāo)的異常。

3.5 2組治療后腸道菌群 16S V3+V4測序

3.5.1 測序質(zhì)量評(píng)估及物種注釋分析 當(dāng)測序序列接近 40 000時(shí)幾乎無新的OTUs產(chǎn)生,表明測序深度足夠,物種累積箱型圖漸進(jìn)平緩,提示樣本量足夠。見圖1。

注:A.樣品稀釋曲線;B.物種累積箱型圖;N.對(duì)照組;Y.試驗(yàn)組

3.5.2 腸道菌群多樣性分析 通過Shannon、Simpson指數(shù)分析2組樣本菌群群落,Alpha多樣性結(jié)果顯示試驗(yàn)組患者腸道菌群較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。進(jìn)一步對(duì)2組樣本進(jìn)行Beta多樣性PCoA分析,結(jié)果試驗(yàn)組菌群樣本聚合度明顯優(yōu)于對(duì)照組,提示組內(nèi)患者間菌群構(gòu)成差異較小。門水平條形圖顯示2組優(yōu)勢菌門均為擬桿菌門(Bacteroidota)和厚壁菌門(Firmicutes),且試驗(yàn)組F/B的值顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見圖2。

注:A.Shannon指數(shù)組間差異條形圖;B.Simpson指數(shù)組間差異條形圖;C.組間PCoA比較圖; D.2組前10菌門條形圖;E.F/B值組間差異條形圖;N.對(duì)照組;Y.試驗(yàn)組;與對(duì)照組比較,*P<0.05。

3.5.3 組間差異屬種篩選 通過統(tǒng)計(jì)豐度前10的菌屬發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬(Bacteroides)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)占主要地位；統(tǒng)計(jì)豐度排名前10的菌種發(fā)現(xiàn)普氏糞桿菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、普通擬桿菌(Bacteroidesvulgatus)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)、黏膜乳桿菌(Lactobacillusmucosae)占主要地位。在此基礎(chǔ)上利用LEfSe分析組間豐度差異顯著的物種，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組的優(yōu)勢屬種為副擬桿菌屬、長雙歧桿菌、黏膜乳桿菌，對(duì)照組優(yōu)勢屬種為擬桿菌屬、糞擬桿菌(Bacteroides-caccae)。見圖3。

注:A.屬水平物種相對(duì)豐度柱狀圖;B.種水平物種相對(duì)豐度柱狀圖;C.LEfSe差異物種;N.對(duì)照組;Y.試驗(yàn)組

4 討論

近年來DM患病率急劇增加,DKD的患病率亦迅速增長,因其低知曉率和高死亡率,現(xiàn)已成為CKD和終末期腎病(ESRD)的主要原因[12]。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為DKD屬于中醫(yī)學(xué)“腎消”“水腫”“虛勞”等范疇[13]。其由消渴病遷延而成,根本病機(jī)在于氣陰不足，燥熱內(nèi)生。內(nèi)熱灼陰,致使腎陰不足;內(nèi)熱傷脾,脾氣不足失于運(yùn)化。脾腎既虧,固攝失常,則見水液停聚,精微下注,發(fā)為本病。李東垣指出“地氣者,人之脾胃也,脾主五臟之氣,腎主五臟之精,皆上奉于天,二者俱主生化以奉升浮,是知春生夏長，皆從胃中出也”[14],重在調(diào)理脾腎二臟。益腎化濕顆粒方中重用黃芪為君藥，臣以人參、白術(shù)健脾益腎補(bǔ)氣，氣行則中焦通達(dá)，氣旺則升發(fā)有力；佐以羌活、獨(dú)活、柴胡、防風(fēng)等諸風(fēng)藥，味薄氣輕而升散之力強(qiáng)，功可升舉陽氣，氣升濕化，祛風(fēng)除濕，可免滋補(bǔ)而戀邪之憂患；白芍養(yǎng)血和營斂陰，又可防諸風(fēng)藥辛燥太過耗氣傷陰；黃連、半夏、陳皮清熱燥濕；茯苓、澤瀉利水滲濕，導(dǎo)濕熱從小便排出，濁邪去，而清陽得升；炙甘草為使藥，調(diào)和諸藥。整方補(bǔ)瀉有度，升降相宜，共奏健脾益腎、升陽化濕之效，為脾虛濕盛證之效方。本研究顯示,試驗(yàn)組可明顯改善患者浮腫,疲倦乏力,食少納呆，便溏，畏寒肢冷等臨床癥狀,且有效率為84%,明顯優(yōu)于對(duì)照組。

研究表明[3, 15]IL-6的釋放增加,可以促進(jìn)炎性巨噬細(xì)胞的浸潤,導(dǎo)致腎小球基底膜增厚,加速腎小球的硬化,從而加快腎小球的損傷。SOD可以催化超氧化物自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫,其活性可反映機(jī)體抗氧化能力,通過減少自由基堆積、破壞足細(xì)胞,減少細(xì)胞外基質(zhì)降解等保護(hù)腎臟。本研究顯示益腎化濕顆粒可有效降低DKD患者UACR、HbA1C、IL-6水平,提高SOD活性和ALB水平,提示益腎化濕顆粒能一定程度降低DKD患者腸道通透性,減少毒素物質(zhì)進(jìn)入循環(huán),降低尿蛋白水平,改善糖代謝,減輕炎癥和氧化應(yīng)激損傷，從而多靶點(diǎn)保護(hù)腎功能,延緩疾病進(jìn)展。

Meijers、Ritz等團(tuán)隊(duì)相繼提出的“腸-腎軸”“腸腎綜合征”[16-17],認(rèn)為腸道菌群失衡與腎臟疾病相互影響。研究表明[18],腸道菌群失調(diào)可增加腸道通透性、黏膜免疫反應(yīng),促進(jìn)腸內(nèi)代謝廢物和致病菌種進(jìn)入血液循環(huán),產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì),減少短鏈脂肪酸含量,加重氧化應(yīng)激損傷,增加胰島素抵抗,促進(jìn)DM進(jìn)展。進(jìn)一步擾亂RAS系統(tǒng)、損傷腎單位,降低腎小球?yàn)V過率,惡化腎功能[19-20]。腎損害導(dǎo)致的循環(huán)代謝廢物過度蓄積通過受損腸壁進(jìn)入腸腔,進(jìn)一步加重腸內(nèi)菌群紊亂,形成腸-腎惡性循環(huán)[21]。江毅等[22]發(fā)現(xiàn)氣虛證患者腸道菌群中厚壁菌門與擬桿菌門的比值較健康人群升高,腸道結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,表明腸道菌群的差異性改變可能是導(dǎo)致氣虛證發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)基礎(chǔ)。內(nèi)濕致病會(huì)使體內(nèi)的腸道菌群穩(wěn)態(tài)遭到破壞,出現(xiàn)腸道菌群失調(diào),同時(shí)腸道菌群失調(diào)也是內(nèi)濕致病的一個(gè)重要病理因素[23]。王卓等[24]發(fā)現(xiàn)脾虛濕盛證大鼠腸道較造模前菌群的數(shù)量及有益菌的種類明顯減少,中藥對(duì)癥治療后菌群逐漸恢復(fù)、中醫(yī)癥狀減輕。故針對(duì)DKD脾虛濕盛證,腸道菌群的分布及豐度亦是重要的作用環(huán)節(jié)。

本研究通過高通量16S rDNA基因測序分析腸道微生物群,發(fā)現(xiàn)2組患者腸道微生物存在一定的差異性。試驗(yàn)組患者Shannon、Simpson指數(shù)高于對(duì)照組,F/B的值遠(yuǎn)低于對(duì)照組。Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)與腸道菌群群落多樣性成正比,F/B的值與腸道菌群紊亂程度成正比。本研究結(jié)果顯示益腎化濕顆粒在一定程度上糾正了DKD患者腸道菌群紊亂,穩(wěn)定了菌群結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步通過LEfSe分析發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組的優(yōu)勢屬種為副擬桿菌屬、長雙歧桿菌和黏膜乳桿菌。有研究表明副擬桿菌屬下的菌種狄氏副擬桿菌可以通過產(chǎn)琥珀酸和次級(jí)膽汁酸,降低糖代謝紊亂程度[25];長雙歧桿菌可以降低血糖,緩解胰島素抵抗,調(diào)節(jié)免疫,改善炎癥狀態(tài)[26-27];黏膜乳桿菌可以改善糖脂代謝,穩(wěn)定屏障功能,減少“腸漏” 及病原體在腸道的定植,降低疾病易感性,后二者都可代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸及醋酸鹽,降低腸道pH值,阻止病原體生長,與其他共生微生物群(例如糞桿菌)構(gòu)建微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò),共同改善腎臟代謝[28-30]。

綜上,益腎化濕顆?？捎行Ц纳艱KD脾虛濕盛證患者的中醫(yī)臨床證候,降低患者血糖、蛋白尿、炎癥及氧化應(yīng)激損傷水平,并可以引起腸道菌群分布及豐度的改變,主要是副擬桿菌屬、長雙歧桿菌及黏膜乳桿菌等益生菌的含量升高。我們接下來將進(jìn)行更為深入的糞菌移植研究。