汪虎，李靖，謝波，張晨嵩，潘成武，張新鑫，王輝，賈建光

在全球范圍內，胃癌(gastric cancer, GC)是第四大常見癌癥，也是導致癌癥相關死亡的第二大主要原因[1- 2]。盡管胃癌的發(fā)病機理和分子生物學機制處于不斷研究中，但是外科手術治療仍然是目前胃癌的唯一根除療法，大部分的胃癌患者因在確診時即為進展期，且腫瘤較早發(fā)生轉移，而喪失最佳治療時期。盡管晚期胃癌的化療方案取得了進展，如5-FU方案和鉑方案，但總生存期(OS)仍不理想。近年來，各種靶向藥物被開發(fā)出來，然而，總體結果仍然令人失望。生物信息學為胃癌的治療帶來了希望。有必要利用生物信息學方法開發(fā)有價值的生物標志物，并預測靶向治療的效果。因此，為早期篩查和診斷選擇新的生物標志物一直是胃癌一級預防和治療的緊迫策略。

圖1 ADAMTS7在多種類型組織中的mRNA表達(TCGA數(shù)據(jù)集)

含Ⅰ型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶7(ADAMTS7)是具有血小板反應蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMTS)家族的成員。近年來，隨著研究的發(fā)展，許多報告已經(jīng)確定了ADAMTS7蛋白在各種發(fā)育組織(包括癌癥)中的功能[3-5]。但是ADAMTS7與胃癌相關性聯(lián)系鮮有報道，本研究中，使用綜合生物信息學分析TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)來確定ADAMTS7在胃癌中具有預后價值。

1 資料和方法

1.1 ADAMTS7基因在泛癌組織中的表達 應用R 語言分析軟件ggplot2包，將ADAMTS7在各種腫瘤組織中的表達水平進行綜合比較[6]。

1.2 ADAMTS7基因在胃癌中表達 應用R軟件BiocManager及l(fā)imma包提取目的基因表達數(shù)據(jù),并利用Perl軟件提取目的基因在胃癌組織及其對應正常胃組織中的表達數(shù)據(jù)。然后,應用R軟件對目的基因表達數(shù)據(jù)及配對數(shù)據(jù)進行可視化[7-8]。其中在非配對樣本中，癌組織375例，正常組織32例。在配對樣本中，癌組織27例，癌旁組織27例。

1.3 預測ADAMTS7對胃癌的診斷價值 應用R軟件pROC及ggplot2包以ADAMTS7的表達量作為診斷胃癌的指標繪制ROC。

1.4 臨床病理特征的獨立預后分析 利用Perl軟件將臨床病理特征與目的基因表達進行整合后獲得獨立預后分析輸入文件,利用R軟件survival及survminer包)對輸入文件進行單因素及多因素Cox回歸分析，同時利用R軟件對相關數(shù)據(jù)進行生存分析。使用N分期、年齡、腫瘤殘留和ADAMTS7水平利用R軟件rms及survival繪制列線圖、ROC曲線、生存率校準曲線[9]。

1.5 目的基因富集分析 利用R軟件clusterProfiler包及GSEA方法來識別2組給定樣本間差異富集的基因和途徑。首先根據(jù)基因與ADAMTS7表達的相關性生成一個基因列表，并根據(jù)樣本隊列中ADAMTS7的中值水平將患者數(shù)據(jù)集分為ADAMTS7高表達組和低表達組。每次分析總共進行1 000個基因集排列。根據(jù)標稱P值和標準化富集分數(shù)(NES)確定富集途徑并進行分類[10]。

2 結果

2.1 ADAMTS7在多種類型組織中的mRNA表達 TCGA數(shù)據(jù)庫分析結果顯示，在33種腫瘤組織中，15種類型腫瘤中ADAMTS7表達水平高于正常組織(P<0.05)，其余18種類型腫瘤中ADAMTS7表達水平與正常組織的表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.2 ADAMTS7在胃癌中的表達狀況 TCGA數(shù)據(jù)庫顯示，在胃癌非配對樣本中，ADAMTS7基因在癌組織中表達水平高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖 2A；在胃癌配對樣本中，ADAMTS7癌組織中表達水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖 2B。

2A 非配對癌組織表達情況 2B 配對癌組織表達情況圖2 ADAMTS7在胃癌中的表達狀況

2.3 預測ADAMTS7對胃癌的診斷價值 為了預測ADAMTS7對胃癌的診斷價值，本課題組以ADAMTS7的表達量作為診斷胃癌的指標繪制ROC曲線，曲線下面積(AUC)0.858(95%CI: 0.799～0.918)。ADAMTS7作為診斷胃癌的指標具有一定的準確性，可能作為預測胃癌的潛在標志物。見圖3。

2.4 ADAMTS7的表達與胃癌患者預后的關系 在 TCGA數(shù)據(jù)庫中，生存分析表明，ADAMTS7高表達患者具有較差的總生存率OS(P=0.007)以及較差的疾病特異生存率DSS(P=0.038)。見圖4A和4B。對數(shù)據(jù)庫中缺失數(shù)據(jù)刪減后行單因素Cox回歸分析顯示ADAMTS7高表達、T3期、T4期、N1期、N3期、M1期、病理分期Ⅱ～Ⅳ期、年齡大于65歲及殘余腫瘤是胃癌生存較差的預后因素，而多因素Cox回歸分析顯示ADAMTS7高表達、N3期、年齡大于65歲及殘余腫瘤是胃癌生存較差的預后因素。見表1。

圖3 預測ADAMTS7對胃癌的診斷價值

4A ADAMTS7表達的OS生存曲線 4B ADAMTS7表達的DSS生存曲線圖4 ADAMTS7表達的OS和DSS生存曲線

表1 ADAMTS7單因素和多因素分析

2.5 基于ADAMTS7表達構建列線圖及驗證預后影響 使用N分期、年齡、腫瘤殘留和ADAMTS7水平作為預測胃癌患者1、3、5年OS的指標構建列線圖(圖5A)。ROC曲線評估列線圖的判別度，1、3、5年AUC分別是0.512、0.605和0.657(圖5B)。校準曲線呈現(xiàn)了1、3、5年臨床結果列線圖的理想預測(圖5C)。綜合上述數(shù)據(jù)表明，ADAMTS7可作為預測胃癌患者OS的有用生物標志物。

2.6 基因集富集分析 通過GSEA確定 ADAMTS7在胃癌中作用的推定細胞機制，結果表明MAPK信號通路和 Hedgehog信號通路是ADAMTS7 高表達表型中差異豐富的途徑。見圖6A、圖6B。

5A 列線圖 5B ROC曲線 5C 校準曲線圖5 基于ADAMTS7表達構建列線圖及驗證預后影響

圖6 基于GSEA的ADAMTS7相關信號通路GSEA富集分析

3 討論

胃癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，也是全球致命的一種腫瘤。目前，手術切除是早期胃癌患者的主要治療方法，而化療是晚期胃癌患者的首選治療方法[11-12]。然而，鑒于癥狀是非特異性的，大多數(shù)胃癌患者被診斷為晚期。因此，確定一種敏感且特異的生物標志物來預測胃癌的預后并作為胃癌治療的靶點至關重要。研究[13-14]表明，隨著多種分子生物學和基因技術的進步，如高通量測序，為研究胃癌的分子機制提供了新的選擇，并且發(fā)現(xiàn)了各種新的靶點[15-17]。

表觀遺傳學(epigenetics)是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達可遺傳變化的一門遺傳學分支學科。表觀遺傳學包含DNA甲基化、染色質可及性與染色質構象和非編碼RNA的轉錄后修飾與組蛋白翻譯后修飾等。近年來，在各個疾病領域，表觀遺傳學的研究越來越多，結合生物信息學技術以及多組學技術，可用來捕獲不同生物過程的基因表達與表觀遺傳改變的相關性。以上這些技術的應用也正迅速成為細胞可塑性和多樣性研究的有力工具，可著眼于癌癥、干細胞等早期的表觀遺傳學變化，對于理解病因、早期診斷及晚期控制等方面具有極高的價值，為基因調控和疾病預后提供了有價值的見解。

ADAMTS7是ADAMTS家族的蛋白水解成員，該家族包括一個信號肽、一個前域、一個金屬蛋白酶結構域、一個類分離素結構域和幾個血栓反應蛋白I型重復序列(TSP1)，由間隔域分隔[18]。用轉化酶(furin或類似furin的酶)裂解ADAMTS前肽是酶活化的典型要求。例如，與PACE4、PC6B和PC7轉化酶相比，furin是ADAMTS7成熟所需的主要轉化酶。α2-巨球蛋白(α2M)與ADAMTS7結合，是ADAMTS7的新底物，而ADAMTS7的金屬蛋白酶結構域是α2M裂解所必需的。已知ADAMTS家族由19種蛋白酶組成，這些酶在發(fā)育、血管生成和凝血中起重要作用，其失調和突變與許多疾病過程有關，如炎癥、癌癥、關節(jié)炎和動脈粥樣硬化[19]。如ADAMTS7形成了自己的亞群具有獨特的特性。有證據(jù)[20-21]表明，ADAMTS-7可能在骨關節(jié)炎的發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用。一項研究[22]發(fā)現(xiàn)，ADAMTS7在關節(jié)炎軟骨和滑膜中顯著上調，雖然在類風濕性關節(jié)炎患者的軟骨中ADAMTS7均顯著上調，但在骨關節(jié)炎患者中卻沒有顯著差異。可見，ADAMTS7在其他疾病中表達存在差異，這些都為我們研究ADAMTS7在胃癌中的作用提供了理論基礎。

然而，ADAMTS7在先前的癌癥研究中鮮有報道，本課題組發(fā)現(xiàn)ADAMTS7在胃癌中起作用。本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫胃癌的基因表達數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)，結果顯示ADAMTS7不論是在非配對樣本中還是在配對樣本中，其在癌組織中的表達均明顯上升。以ADAMTS7的表達量作為診斷胃癌的指標繪制ROC，AUC為0.858，其具有一定的準確性。生存分析表明，高ADAMTS7表達具有較差的OS以及較差的DSS。單因素COX回歸分析顯示ADAMTS7高表達、T3期、T4期、N1期、N3期、M期、年齡大于65歲及殘余腫瘤是胃癌生存較差的預后因素，而多因素COX回歸分析顯示ADAMTS7高表達、N3期、年齡大于65歲及殘余腫瘤是胃癌生存較差的預后因素。為了進一步預測ADAMTS7在胃癌中的作用機制，利用GSEA富集分析進行預測，結果表明MAPK信號通路和 Hedgehog信號通路是 ADAMTS7 高表達表型中差異豐富的途徑。這些結果表明ADAMTS7在胃癌中高表達，可能通過MAPK信號通路和Hedgehog信號通路影響胃癌的預后，其可能是胃癌的新的診斷指標。

綜上所述，本研究通過生物信息學方法和大數(shù)據(jù)分析從不同層面詮釋了ADAMTS7在胃癌中的表達及其臨床意義。即ADAMTS7的高表達水平在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中可能起著重要作用，有望成為胃癌診治和預后判斷的重要指標和新的靶點。但生物信息學方法同樣存在著局限性，仍然需要更多的相關實驗數(shù)據(jù)進行證實。