張 欣 張 祺 潘 軍 周建峰, 白 艷 榮小至,

(1.中國海洋大學醫(yī)藥學院海洋藥物教育部重點實驗室, 青島 266003; 2.青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室, 青島 266237)

在脊椎動物胚胎中, 原腸化運動是驅(qū)動胚層形成及體軸形成的形態(tài)發(fā)生運動。原腸化運動中的匯聚延伸(Convergence and extension, CE)運動在胚體“塑形”過程中發(fā)揮著非常重要的作用。CE運動是形態(tài)發(fā)生的主要過程, 該過程中胚層在中外側(cè)方向變窄, 同時沿著背部中線在前后端方向延伸[1—5]。胚胎通過CE運動實現(xiàn)體軸的建立, 在脊椎動物中CE運動的詳細分子機制還有待深入研究。目前已知非經(jīng)典的Wnt/PCP (Planar cell polarity)信號通路是調(diào)控CE運動的關(guān)鍵信號[6—11]。Wnt/PCP信號通路可以通過Wnt配體的非經(jīng)典家族成員(包括Wnt4、Wnt5a和Wnt11)與Frizzled受體之間的相互作用而被激活, 然后由一些下游成分如小分子GTP酶Rho A和Rac、Jun N端激酶(Jun N-terminal kinase, JNK)介導, 進而調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合和細胞骨架動力學[12—17]。

Rspo1 (R-spondin 1)是分泌型Rspos (R-spondins)蛋白家族的成員, 它能協(xié)同Wnt配體增加Wnt/β-catenin信號通路的活性[18,19]。人(Homo sapiens)RSPO1基因突變會導致一種隱性綜合征, 其特征是XX性別逆轉(zhuǎn), 并伴有掌跖角化病, 易于罹患鱗狀細胞癌[20]。在小鼠(Mus musculus)中敲除Rspo1會影響卵巢的分化, 提示Rspo1在雌性發(fā)育中發(fā)揮重要作用[21,22]。在斑馬魚(Danio rerio)中研究發(fā)現(xiàn), Rspo1-Wnt調(diào)控信號能促進血管生成, 且Rspo1通過激活Wnt/β-catenin信號通路特化造血干細胞[23,24]。最近, 有報道表明Rspo1/RSPO1具有非依賴Wnt/βcatenin的作用, 它能通過Rspo1-Lgr4-cAMP-ERα軸調(diào)節(jié)雌激素受體的表達, 并且在結(jié)腸癌中RSPO1/LGR5能介導TGFβ信號的激活[25,26]。鑒于Rspo1多方面的調(diào)控作用, 我們推測Rspo1參與了胚胎早期的發(fā)育。

本研究利用模式動物斑馬魚, 通過過表達和敲降實驗揭示了Rspo1對胚胎早期匯聚延伸運動的調(diào)控作用, 并對其作用機制進行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

KOD DNA聚合酶購于Toyobo公司, 限制性內(nèi)切酶購于New England BioLabs公司, TRIzol購于Invitrogen公司; M-MLV及Dual-Luciferase Assay Kit購于Promega公司, DIG RNA labeling mix購于Roche公司, mMESSAGE mMACHINE Kit購于Ambion公司, 磷酸化SAPK/JNK抗體(貨號9251)購于Cell Signaling Technology公司, SAPK/JNK抗體(貨號SC-571)及β-Catenin抗體(貨號SC-7199)購于Santa Cruz Biotechnology公司, 反義寡核苷酸(Morpholino, MO)由Gene-Tool公司設計合成。

1.2 斑馬魚品系

本研究以野生型斑馬魚Tübingen品系為研究對象。通過自然交配獲得受精卵, 置于胚胎培養(yǎng)液中, 28.5℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 胚胎分期根據(jù)發(fā)育階段劃分標準進行[27]。動物實驗操作采用三卡因麻醉, 并盡量將痛苦降至最低。所有實驗均符合中國海洋大學的實驗動物指導要求。

1.3 反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)及整胚原位雜交(WISH)

用TRIzol試劑提取斑馬魚胚胎的總RNA, 用MMLV反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。用含有rspo13'UTR(Untranslated region)的質(zhì)粒及DIG RNA labeling mix按照標準步驟制備正義和反義RNA探針。PCR引物序列如下:rspo1-RT-F: 5'-CCCCGACTCT TCATCTTACTG-3';rspo1-RT-R: 5'-TTCTTGT TTCCTCCTCTTTCC-3';β-actin-RT-F: 5'-CTTGCGGTA TCCACGAGAC-3';β-actin-RT-R: 5'-GCGCCATA CAGAGCAGAA-3';rspo1-probe-F: 5'-GAACTAAG ATGCTGGCTCG-3';rspo1-probe-R: 5'-CCGTAA CAGTCCGTCAAT-3'。

1.4 Capped mRNA的合成、MO的合成及顯微注射

Capped mRNA根據(jù)說明書用mMESSAGE mMACHINE Kit合成。為了敲降rspo1, 由Gene-Tool公司專業(yè)人員設計合成兩個互不重疊的特異封閉rspo1基因翻譯的反義MOs, 并如報道所述方法稀釋[28,29]。構(gòu)建翻譯抑制型MOs有效性檢測特異報告質(zhì)粒, 即rspo15'-UTR-GFP。將包含rspo1MO靶點的5'UTR序列(–200— –1堿基序列)和部分ORF序列(ATG起始, 1—316堿基序列), 即–200—316堿基序列, 連接至pCS2-eGFP表達載體, 用于檢測MOs的有效性。將稀釋的mRNA和/或MOs和/或DNA質(zhì)粒注射到1細胞期的斑馬魚胚胎中。

1.5 熒光素酶活性檢測

體內(nèi)熒光素酶檢測方法如報道所述[28,29]。在1細胞期的胚胎中注射100 pg AP-1報告質(zhì)粒和20 pg Renilla內(nèi)參報告質(zhì)粒, 與MOs和/或mRNA進行共注射。待胚胎發(fā)育至90%下包時期, 每組設兩個平行,分別收集15枚以上胚胎進行裂解。使用Dual-Luciferase Assay Kit進行熒光素酶活性檢測。以Renilla熒光素酶活性為內(nèi)參計算AP-1報告質(zhì)?；钚韵鄬χ怠?/p>

1.6 蛋白印跡(Western Blot)

斑馬魚胚胎發(fā)育至所需時期時, 去除卵膜, 每3條魚加入1 μL RIPA裂解液(50 mmol/L Tris pH 7.4,150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5%脫氧膽酸鈉, 蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑現(xiàn)用現(xiàn)加)研磨裂解, 將裂解液12000×g離心, 保留上清液。每個樣本都用相應的抗體進行SDS-PAGE蛋白印跡。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism version 5.01軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)以means±SE表示, 組間差異用t-Test方法進行分析, 當P<0.05時認為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 敲降或過表達斑馬魚rspo1基因影響胚胎匯聚延伸運動

為了研究Rspo1蛋白在斑馬魚胚胎中的功能,我們通過參考斑馬魚基因組數(shù)據(jù)庫, 克隆了斑馬魚rspo1基因。斑馬魚Rspo1是分泌型Rspos家族的成員, 它含有一個信號肽(Signal peptide, SP)結(jié)構(gòu)域、2個FU (Furin-like)結(jié)構(gòu)域FU1和FU2及1個TSP1(Thrombospondin type I repeat)結(jié)構(gòu)域(圖1A)。首先檢測斑馬魚rspo1的時空表達模式。RT-PCR結(jié)果表明, 斑馬魚rspo1是母源性基因, 在受精后小時數(shù)(Hours post fertilization, hpf)為0—4時即能檢測到表達, 且表達量較高。rspo1的表達在6—24hpf時下降, 但從36hpf開始升高(圖1B)。斑馬魚rspo1反義探針的原位雜交結(jié)果表明, 在1細胞期到12hpf早期胚胎中,rspo1呈全身性表達模式(圖1C)。rspo1的普遍表達和動態(tài)表達表明, 斑馬魚Rspo1可能在胚胎發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

圖1 斑馬魚Rspo1蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖及mRNA時空表達譜Fig.1 Zebrafish Rspo1 protein structure and mRNA spatiotemporal expression pattern

為了研究rspo1基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中的作用, 我們首先進行了體內(nèi)過表達實驗。在1細胞期注射rspo1的capped mRNA, 待胚胎發(fā)育至12hpf進行觀察。與未注射組(WT)及注射對照組(gfp)相比,rspo1注射組胚胎出現(xiàn)明顯的CE運動缺陷, 胚胎頭尾端未能延伸到正常位置, 二者之間夾角變大(圖2A和2B)。為了進一步研究rspo1在胚胎發(fā)育中的作用, 我們用兩個互不重疊的、特異靶向rspo15′UTR的反義MOs, 即rspo1MO1 (靶向–54—–30區(qū)域)和MO2 (靶向–21—4區(qū)域), 阻斷內(nèi)源rspo1mRNA翻譯進程, 可抑制母源mRNA和合子型mRNA的翻譯, 用以在斑馬魚胚胎中進行基因敲降實驗(圖2C)。通過將MOs (MO1和MO2)與rspo15'-UTR-GFP表達載體在斑馬魚胚胎共注射來評價MOs靶向rspo1的效率, 我們發(fā)現(xiàn)MO1和MO2都能成功地封閉檢測質(zhì)粒的GFP標簽的表達(圖2D)。隨后, 將MO1 (8 ng)或MO2 (6 ng)在1細胞期注射到斑馬魚胚胎。與空白對照組(WT)及注射對照組(cMO)相比, MO1和MO2注射組胚胎在12hpf時期均表現(xiàn)出CE運動缺陷, 前后端夾角變大(圖2E和2F)。將低劑量的rspo1mRNA與MO1或MO2共同注射, 能營救MO單獨注射所誘導的CE運動缺陷表型, 這表明MOs敲降作用是特異的(圖2F)。

研究表明Rspo1可以增強Wnt/β-catenin信號通路, 而Wnt/β-catenin信號通路對背腹軸的形成起關(guān)鍵作用[30—32]。背腹軸形成可能會影響CE運動[31],為揭示rspo1過表達或敲降引起的CE運動缺陷是否與早期胚胎背腹軸分化有關(guān), 我們用WISH方法檢測了敲降rspo1的6hpf胚胎中背腹軸標記基因的表達模式。背側(cè)標記基因chd(chordin)和腹側(cè)標記基因eve1(even-skipped-1)在rspo1敲降胚胎中表達模式與對照組相比無明顯差異, 表明rspo1敲降導致的胚胎CE運動缺陷不是由于背腹軸的改變引起的(圖2G)。隨后進一步檢測了與胚胎CE運動相關(guān)的標記基因, 神經(jīng)外胚層邊緣區(qū)域標記基因dlx3b(distal-less homeobox 3b)、脊索前板標記基因hgg(hatching gland)和脊索標記基因ntl(no tail), 以探究rspo1基因敲降對胚胎CE運動的影響。如圖2H所示, 與WT和cMO對照組胚胎相比,dlx3b、ntl和hgg的表達模式在rspo1敲降胚胎中發(fā)生了改變。對照組hgg的位置位于dlx3b(垂直線)前面,dlx3b呈中等寬度(水平線),ntl呈后部細表達(星號), 而在rspo1敲降胚胎中, 脊索前板(hgg)后移、神經(jīng)板(dlx3b)變寬、脊索(ntl)變粗。上述研究結(jié)果表明過表達和敲降rspo1均會導致胚胎CE運動缺陷。已知一些CE調(diào)控基因的功能-獲得或功能-缺失都會影響原腸化運動, 這些結(jié)果表明Rspo1是斑馬魚原腸胚期維持正常CE運動所必需的。

圖2 rspo1的過表達或敲降會影響胚胎的CE運動Fig.2 Overexpression or knockdown of rspo1 impairs convergence and extension movements during gastrulation

2.2 Rspo1通過抑制Wnt/PCP信號調(diào)控胚胎匯聚延伸運動

Wnt/PCP信號通路參與胚胎的CE運動, 并通過介導轉(zhuǎn)錄因子ATF2和c-jun的表達激活JNK信號[33]。Rspo1是一種分泌型蛋白, 如果它參與Wnt/PCP信號通路, 則會影響轉(zhuǎn)錄因子ATF2的激活。熒光素酶報告質(zhì)粒AP-1能響應ATF2的激活[34,35], 因此, 為了探究Rspo1和Wnt/PCP信號通路之間的分子相關(guān)性, 我們使用AP-1質(zhì)粒對該信號通路活性進行檢測。在斑馬魚胚胎1細胞期注射不同劑量的rspo1mRNA, 然后在9hpf時檢測AP-1報告質(zhì)粒的活性。與gfp注射組相比, 注射rspo1mRNA抑制了AP-1報告質(zhì)粒的活性, 其抑制作用呈劑量依賴性(圖3A)。與之相反, 斑馬魚中rspo1的敲降以劑量依賴的方式增加了AP-1報告質(zhì)粒的活性(圖3B)。這表明斑馬魚胚胎中Rspo1能抑制JNK信號活性。為了進一步檢測Rspo1是否調(diào)控Wnt/PCP信號通路, 我們研究了原腸化運動中表征Wnt/PCP信號通路活性的磷酸化JNK的水平。與對照組相比,rspo1敲降的胚胎中磷酸化JNK水平顯著升高(圖3C)。為了進一步研究Rspo1是否通過這一途徑調(diào)節(jié)CE運動, 我們用負顯性JNK (Dominant negative JNK, dnJNK)來檢測Rspo1和JNK之間的遺傳互作。當單獨注射低劑量的dnJNKmRNA (100 pg)或rspo1mRNA(300 pg)時, 少數(shù)胚胎出現(xiàn)CE缺陷(分別占總數(shù)的4%和15%; 圖3D), 而兩者共注射則協(xié)同增加了CE缺陷胚胎比例(占總數(shù)的54%; 圖3D)。綜上所述, 這些結(jié)果表明Rspo1通過抑制Wnt/PCP信號來調(diào)節(jié)CE運動。

圖3 斑馬魚胚胎中Rspo1抑制Wnt/PCP信號通路Fig.3 Rspo1 inhibits Wnt/PCP signaling in zebrafish embryos

2.3 rspo1的敲降及wnt11和wnt5b的過表達協(xié)同誘導CE運動缺陷

為了進一步證實Rspo1對Wnt/PCP信號通路的抑制作用, 我們將rspo1MOs與wnt11或wnt5bmRNA共同注射至斑馬魚胚胎, 觀察rspo1基因敲降后是否能增強Wnt11或Wnt5b在CE運動中的作用。已有研究表明, 斑馬魚中Wnt11主要表達在前端軸旁中內(nèi)胚層, 注射wnt11mRNA可導致48hpf斑馬魚眼睛呈現(xiàn)輕度(C1)、中度(C2)、重度(C3)的融合表型[36](圖4A)。因此, 我們通過眼睛融合程度判斷rspo1基因敲降能否增強Wnt11在前端的作用。單獨注射低劑量的wnt11mRNA (100 pg)只導致輕度的眼睛發(fā)育缺陷: 5%的胚胎呈現(xiàn)C1表型(圖4B)。單獨注射低劑量rspo1MOs (4 ng MO1或3 ng MO2)的胚胎沒有表現(xiàn)出此類表型(圖4B)。然而, 共注射rspo1MOs和wnt11mRNA協(xié)同影響CE運動, 顯著增強了眼睛發(fā)育缺陷: 20%—25%的胚胎呈現(xiàn)C1表型, 20%—25%的胚胎呈現(xiàn)C2或C3表型(圖4B)。此外, 有研究表明wnt5b過量表達主要影響斑馬魚后端的匯聚延伸運動[37], 因此, 我們通過斑馬魚后端匯聚延伸運動缺陷程度判斷rspo1基因敲降能否增強Wnt5b的作用。結(jié)果表明, 低劑量的rspo1MOs和wnt5bmRNA單獨注射時不影響CE運動, 共同注射時協(xié)同產(chǎn)生嚴重的CE缺陷, 具體表現(xiàn)為krox20標記的中外側(cè)距離變寬且myod標記的肌節(jié)長度縮短(圖4C—E)。因此, Rspo1和Wnt11或Wnt5b在Wnt/PCP信號通路的調(diào)控中存在遺傳互作。綜上所述, Rspo1在早期發(fā)育過程中能抑制Wnt/PCP信號通路。

圖4 rspo1的敲降協(xié)同增強Wnt11和Wnt5b誘導的CE運動缺陷Fig.4 Knockdown of rspo1 synergistically enhanced Wnt11 and Wnt5b induced convergence and extension defects

3 討論

在本研究中, 我們通過功能-獲得和功能-缺失分析, 研究了Rspo1在斑馬魚原腸化運動中的作用。我們發(fā)現(xiàn)rspo1的過表達和敲降都會導致斑馬魚胚胎的CE缺陷。rspo1的過表達降低Wnt/PCP信號通路報告質(zhì)?；钚? 而rspo1的敲降則增加該通路活性。斑馬魚胚胎中敲降rspo1增加內(nèi)源性JNK的磷酸化水平, 這是Wnt/PCP信號激活的一個標志。相反,rspo1的過表達協(xié)同增強了dnJNK對原腸化CE運動的抑制作用。此外,rspo1的敲降可以協(xié)同增強Wnt11和Wnt5b這兩個非經(jīng)典的Wnt配體誘導的CE缺陷。綜上所述, Rspo1通過抑制Wnt/PCP信號通路來調(diào)節(jié)原腸化運動中CE運動。

多個報道證明, Rspo1作為Lgr家族成員Lgr4/5/6的配體, 在Wnt配體存在的情況下增強Wnt/β-catenin信號水平[38—40]。值得注意的是, 一些組分在Wnt/β-catenin通路與Wnt/PCP信號通路中具有相反的功能。例如, Wnt/β-catenin通路受體LRP6的胞外區(qū)能抑制Wnt/PCP信號[41]; Wnt/β-catenin通路的抑制因子Dkk1能激活Wnt/PCP信號[42]。與Dkk1類似,Waif1/5T4、Ptk7抑制Wnt/β-catenin信號通路而促進Wnt/PCP通路[37]。我們的研究表明, Rspo1能激活Wnt/β-catenin信號通路, 但抑制Wnt/PCP通路, 其詳細的分子機制還需要進一步的研究來闡明。

幾項關(guān)于非洲爪蟾的體內(nèi)研究表明, Rspos家族的成員Rspo3通過結(jié)合Lgrs或Sdc4 (Syndecan 4)這兩種不同的受體, 既能增強Wnt/β-catenin信號,也能增強Wnt/PCP信號[35,40]。這與在斑馬魚胚胎中觀察到的Rspo1對Wnt/PCP信號的抑制作用不一致,推測可能的原因, 第一, Sdc4通過Rspo3介導Wnt/PCP信號通路, 而Rspo1與Sdc4之間的結(jié)合親和力低于Rspo3與Sdc4之間的結(jié)合親和力, 甚至未能檢測到Rspo1與Syndecans之間的細胞表面結(jié)合[35]。這表明Rspo1可能不與這類受體相互作用, 因此無法促進Wnt/PCP信號通路水平。第二, Wnt/β-catenin信號的激活可能導致Wnt/PCP信號的抑制。有研究表明, 在斑馬魚胚胎中Rspo1能通過增強Wnt/β-catenin信號通路活性來特化造血干細胞[23,24]。Rspo1在斑馬魚胚胎原腸化運動中對Wnt/PCP信號的抑制作用可能是Wnt/β-catenin信號激活導致的次級作用。第三, 斑馬魚胚胎中可能存在一種未知蛋白介導Rspo1的抑制作用, 其導致Wnt/PCP信號減弱的機制尚不清楚。

在斑馬魚中已有幾項關(guān)于rspo1基因敲除突變體及基因敲降突變體的研究[23,24], 但這些研究并未報道rspo1突變體存在CE運動缺陷。推測可能有以下幾種原因。第一, 已報道的rspo1基因敲除突變體僅存在TSP結(jié)構(gòu)域中第193位絲氨酸突變?yōu)榱涟彼? 該突變可能不足以影響Wnt/PCP信號通路[24]。第二, 母源rspo1mRNA可能參與發(fā)揮作用。通過TALEN及CRISPR/Cas9等技術(shù)構(gòu)建的基因敲除突變體及使用的剪接阻斷型MO構(gòu)建的基因敲降突變體對母源mRNA影響不大。第三, 斑馬魚基因組包含rspo1、rspo2、rspo3、rspo4四個rspo基因, 最近有研究表明, 基因敲除導致無義mRNA引起的降解可能激活同源基因的表達, 進行功能補償, 導致突變體沒有表型[43]。本研究中使用翻譯阻斷型MO進行rspo1基因敲降, 這可能也是導致表型與上述研究存在差異的原因。

綜上所述, 我們的研究結(jié)果表明, Rspo1通過抑制Wnt/PCP信號通路來調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎原腸化運動中的CE運動。Rspo1在Wnt/PCP信號通路中的作用表明, Rspos家族的功能可能比我們目前已知的更為復雜。Rspo1抑制Wnt/PCP信號轉(zhuǎn)導的分子機制有待進一步研究。我們的研究為進一步探索脊椎動物中Wnt/PCP信號的調(diào)控提供了新的研究思路。