符 鵬 岳華梅 阮 瑞 葉 歡 李 忠 李創(chuàng)舉

(中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護重點實驗室, 武漢 430223)

黃鱔(Monopterus albus), 俗稱鱔魚, 隸屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)、合鰓目(Synbranchiformes)、黃鱔屬(Monopterus), 是一種典型具有性轉(zhuǎn)換的魚類(先雌后雄), 同時也是我國一種重要的淡水特種經(jīng)濟魚類之一[1]。黃鱔全人工繁殖技術(shù)雖已突破[2],但目前仍然存在一些瓶頸, 如人工繁殖親魚主要依賴于捕撈的野生資源; 人工養(yǎng)殖的黃鱔親魚量不能滿足當前的規(guī)模化人工繁殖需求; 人工配合飼料飼喂的雌性黃鱔卵巢成熟度差, 導致親鱔繁殖性能不佳, 受精率低等問題。當前市售黃鱔的全人工配合飼料尚不能滿足黃鱔親魚生長及性腺發(fā)育的需要,因此如何改善配合飼料配方, 提升養(yǎng)殖親鱔生長繁殖性能是當前研究的熱點。

南極磷蝦粉(Antarctic krill meal)是替代魚粉理想的優(yōu)質(zhì)蛋白源之一, 其氨基酸種類齊全, 脂肪量與一級紅魚粉含量相當, 同時還含有天然的抗氧化劑——蝦青素[3,4]和條件性必需氨基酸——?；撬醄5]。研究表明南極磷蝦粉能夠提高魚類的生長性能、肌肉品質(zhì)、免疫代謝能力及繁殖性能。例如, 在飼料中添加一定比例的南極磷蝦粉能夠顯著提高銀鯧(Pampus argenteus)[6]、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[7]、黃鱔(Monopterus albus)[8]和鱈(Gadus cha-lcogrammus)[9]等魚類的生長性能。南極磷蝦粉添加能夠改善黃顙魚[7]、大黃魚(Larimichthys crocea)[10]和虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[11]等魚類的肌肉品質(zhì), 并顯著提高黃鱔[8]、圓斑星鰈(Verasper variegatus)[12]和歐洲鱸(Dicentrarchus labrax)[13]等魚類的免疫代謝能力。在繁殖性能方面, 飼喂含南極磷蝦粉的配合飼料能夠顯著提高凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的性腺指數(shù)[14], 以及半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)的相對產(chǎn)卵量[15]。基于此, 本研究以二冬齡雌性黃鱔為研究對象, 檢測人工配合飼料中不同比例南極磷蝦粉替代魚粉對其生長性能、抗氧化能力、非特異性免疫及生殖性能的影響, 以期為養(yǎng)殖雌性黃鱔的飼料配方優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

飼料以魚粉(秘魯)和南極磷蝦粉(青島市遠洋捕撈有限公司)、脫脂豆粕(甘肅華羚乳品集團公司)、雞肉粉(美國溫澤世家有限公司)作為蛋白源,魚油(福州開發(fā)區(qū)高龍實業(yè)有限公司)作為脂肪源,小麥面粉(唐河縣恒昌面粉有限公司)作為糖源。實驗通過設(shè)置0(Diet 1)、20%(Diet 2)、40%(Diet 3)、60%(Diet 4)、80%(Diet 5)和100%(Diet 6)的磷蝦粉替代魚粉配制6組等氮等能飼料(表1)。飼料原料經(jīng)粉碎后過60目篩, 按表1配比精確稱量, 然后充分混勻, 原料用量較低者采取逐漸混合法添加。采用32型制粒機(浙江民益食品機械有限公司)將飼料預混料加工成直徑約為2.00 mm的長條狀飼料, 烘干破碎后將飼料密封放置于–20℃冰柜中備用。飼料在投喂前加入20%自來水, 團成團狀后進行飼喂。

表1 實驗飼料的組成與營養(yǎng)成分(干重, g/kg)Tab.1 Composition and nutritional composition of experimental diets (dry weight basis, g/kg)

1.2 養(yǎng)殖管理

實驗魚購自湖北省仙桃市張溝鎮(zhèn)忠善黃鱔養(yǎng)殖合作社, 養(yǎng)殖場地為該合作社池塘網(wǎng)箱。池塘網(wǎng)箱規(guī)格為2.00 m×1.00 m×1.50 m(長×寬×高), 養(yǎng)殖水深為1.67 m。實驗共計6個處理組, 每處理組設(shè)3個平行, 每個平行組選用健康無損傷的初始體質(zhì)量為(36.41±3.62) g二冬齡雌性黃鱔50尾, 養(yǎng)殖周期為12周。養(yǎng)殖采用表觀飽食投喂法, 除極端惡劣天氣不進行投喂外每天下午5:30—6:30投喂1次。每6天停止投喂1次, 投喂后1h內(nèi)及時撈出殘餌, 后烘干稱重。實驗養(yǎng)殖用水為池塘水加地下水, 養(yǎng)殖周期內(nèi),溶解氧5.98—7.72 mg/L, pH范圍7.50—7.70, 氨氮平均值為2.03 mgN/L, 水體硬度92德國度, 養(yǎng)殖水溫為22.60—28.90℃。

1.3 樣品采集與測定

在養(yǎng)殖試驗結(jié)束后, 所有魚經(jīng)24h饑餓處理, 隨后進行逐箱稱重及尾數(shù)統(tǒng)計, 以統(tǒng)計分析生長相關(guān)指標, 包括增重率(Weight gain rate, WGR)以及特定生長率(Specific growth rate, SGR)。每個網(wǎng)箱隨機選取9尾魚, 采用100 mg/L MS-222(Sigma, St.Louis,MO, USA)麻醉處理后, 稱取個體體重及體長, 以計算肥滿度(Condition factor, CF)。解剖分離全部內(nèi)臟組織并稱重, 用于臟體比(Viscerosomatic index, VSI)的測定; 取肝臟組織, 保存于–80℃冰箱, 用于肝體比(Hepatosomatic index, HSI)、抗氧化指標及非特異性免疫指標的測定。解剖取卵巢組織稱重, 用于性腺指數(shù)(Gonadosomatic index, GSI)指標的測定;隨后同時取背部肌肉和卵巢樣品凍存, 用于后續(xù)相關(guān)營養(yǎng)成分指標的測定。

實驗飼料、肌肉和卵巢的營養(yǎng)成分測定采用標準方法進行, 粗蛋白質(zhì)測定采用微量凱氏定氮法,粗脂肪測定采用索氏抽提法, 粗灰分測定采用550℃灼燒法, 水分測定采用105℃烘干法。肝臟抗氧化指標包括過氧化氫酶(Catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)和丙二醛(Malondialdehyde, MDA), 以及非特異性免疫指標包括堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)、補體C4(Complement 4, C4)和免疫球蛋白M (Immunoglobulin M, IgM), 均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相關(guān)試劑盒測定, 相應操作參照說明書進行。

為進行雌鱔個體生殖力指標測定, 在各個養(yǎng)殖網(wǎng)箱再隨機抽取9條魚, 麻醉后稱重, 隨后尾柄處靜脈采血1.50 mL, 4℃靜置過夜, 然后3000 r/min離心10min, 小心分離上層血清, 置于–80℃保存?zhèn)溆谩Ｑ宕贫己繙y定采用美國Cayman CHEMICAL公司的Estradiol ELISA Kit試劑盒(Item No.501890)進行。解剖分離性腺稱重后保存于PBS溶液中, 統(tǒng)計具有卵黃顆粒積累的卵細胞數(shù)目, 以便后期計算絕對懷卵量、相對懷卵量等指標; 卵細胞直徑采用體式顯微鏡(Olympus)目鏡測微尺測定。

1.4 計算公式

增重率(WGR, %)=100×(終末體重–初始體重)/初始體重

特定生長率(SGR, %)=100×[(ln終末體重–ln初始體重)/投喂天數(shù)]

飼料系數(shù)(FCR)=攝食量/(終末體重–初始體重)

肥滿度(CF, g/cm3)=100×魚體體重/(體長)3

肝體比(HSI)=100×肝胰重/終末體重

臟體比(VSI)=100×內(nèi)臟重/終末體重

性腺指數(shù)(GSI)=100×性腺重/終末體重

絕對懷卵量(F, 粒)=一條魚的卵?？倲?shù)量

相對懷卵量(RF, 粒/g)=絕對懷卵量/終末體重

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準誤(mean±SE) 表示,采用SPSS 22.0進行單因素方差分析, Duncan法進行多重比較,P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 南極磷蝦粉替代魚粉對雌鱔生長性能及形體指標的影響

黃鱔的增重率(WGR)和特定生長率(SGR)在對照組(Diet 1)、20%磷蝦粉替代組(Diet 2)、40%替代組(Diet 3)之間無顯著性差異(P>0.05; 表2)。隨著替代水平的進一步提高, 其增重率和特定生長率呈下降趨勢(P<0.05)。20%替代組飼料系數(shù)(FCR)與對照組無顯著性差異(P>0.05), 隨著替代水平的提高, 飼料系數(shù)隨之升高(P<0.05)。

形體指標統(tǒng)計結(jié)果顯示, 對照組黃鱔臟體比(VSI)顯著高于80%替代組(Diet 5)和100%替代組(Diet 6;P<0.05), 而與其他組無顯著性差異(P>0.05)。20%替代組肝體比(HSI)與對照組無顯著性差異(P>0.05), 但顯著高于其他四個高水平替代組(P<0.05)。黃鱔肥滿度(CF)各組間無顯著性差異(P>0.05; 表2)。

表2 南極磷蝦粉替代魚粉對雌性黃鱔生長性能和形體指標的影響Tab.2 Effects of Antarctic krill meal substitution of fish meal on growth performance and morphometrical parameters of female Monopterus albus

2.2 南極磷蝦粉替代魚粉對雌鱔肌肉及卵巢組織營養(yǎng)組成的影響

由表3可看出, 20%磷蝦粉替代組粗蛋白質(zhì)含量顯著高于其他組(P<0.05), 100%替代組粗蛋白含量最低。對照組粗脂肪含量與20%和60%組之間無顯著性差異(P>0.05), 但顯著高于其他3個替代組(P<0.05)。對照組粗灰分含量顯著高于100%替代組(P<0.05), 但與其他組之間無顯著性差異(P>0.05)。各組間黃鱔肌肉中水分含量無顯著性差異(P>0.05)。

表3 南極磷蝦粉替代魚粉對雌性黃鱔肌肉體成分的影響Tab.3 Effects of Antarctic krill meal instead of fish meal on muscle composition of Monopterus albus (%)

進一步對各組黃鱔卵巢組織營養(yǎng)成分進行分析表明, 隨替代水平的升高, 粗蛋白質(zhì)含量呈逐漸下降趨勢, 20%和40%組粗蛋白質(zhì)含量與對照組之間無顯著差異(P>0.05; 表4)。40%組粗脂肪含量顯著高于對照組及其他各替代組(P<0.05)。20%組粗灰分含量顯著高于對照組(P<0.05), 隨替代水平的升高, 粗灰分含量呈下降趨勢。80%和100%替代組卵巢水分含量顯著高于其他組(P<0.05)。

表4 南極磷蝦粉替代魚粉對雌性黃鱔卵巢組織營養(yǎng)成分的影響Tab.4 Effects of Antarctic krill meal substitution of fish meal on ovary nutrient composition of female Monopterus albus (%)

2.3 南極磷蝦粉替代魚粉對雌鱔肝臟抗氧化及非特異性免疫指標的影響

由表5可以得出, 對照組過氧化氫酶(CAT)活性顯著高于100%替代組(P<0.05), 但與其他組之間無顯著性差異(P>0.05)。20%替代組超氧化物歧化酶(SOD)活性與對照組及40%替代組之間無顯著性差異(P>0.05), 但顯著高于60%、80%和100%替代組(P<0.05)。對照組丙二醛(MDA)含量與20%替代組之間無顯著性差異(P>0.05), 但顯著低于其他水平替代組(P<0.05)。

表5 南極磷蝦粉替代魚粉對雌性黃鱔肝臟抗氧化及非特異性免疫指標的影響Tab.5 Effects of Antarctic krill meal substitution of fish meal on parameters of anti-oxidation and non-specific immunity in liver of female Monopterus albus

非特異性免疫指標檢測包括堿性磷酸酶(AKP)、補體C4及免疫球蛋白M(IgM)。對照組AKP活性與20%替代組之間無顯著性差異(P>0.05), 但顯著低于60%、80%及100%水平替代組(P<0.05)。40%替代組C4含量顯著高于其他組(P<0.05), 而對照組與20%組之間無顯著性差異(P>0.05)。20%組免疫球蛋白M(IgM)含量與對照組之間無顯著性差異(P>0.05), 但顯著高于80%及100%替代組(P<0.05)。

2.4 南極磷蝦粉替代魚粉對雌鱔個體生殖力的影響

表6表明, 對照組性腺指數(shù)(GSI)與各組之間無顯著性差異(P>0.05)。絕對懷卵量(F)隨替代水平的升高呈下降趨勢, 20%、40%和80%替代組與對照組之間無顯著性差異(P>0.05)。對照組相對懷卵量(RF)顯著高于100%替代組(P<0.05), 但與其他組之間無顯著性差異(P>0.05)。隨磷蝦粉替代水平的升高, 卵粒直徑有增大趨勢, 對照組卵粒直徑顯著低于其他各組(P<0.05), 其中100%替代組卵粒直徑最大, 顯著高于對照組和20%替代組(P<0.05)。20%和40%組血清雌二醇含量與對照組之間無顯著差異(P>0.05), 但顯著高于其他替代組(P<0.05)。

表6 南極磷蝦粉替代魚粉對雌性黃鱔個體生殖力的影響Tab.6 Effect of Antarctic krill meal substitution of fish meal on individual fecundity of female Monopterus albus

3 討論

3.1 南極磷蝦粉替代魚粉對雌性黃鱔生長性能及形體指標的影響

已有研究表明, 適量的磷蝦粉替代魚粉可能對水產(chǎn)動物的生長無不利影響或有一定的促進作用,而磷蝦粉替代高水平或全部的魚粉可能會導致魚體的生長性能和飼料效率下降[12]。南極磷蝦粉替代魚粉對大規(guī)格銀鯧(Pampus argenteus)的生長性能及成活率均無顯著影響[6]。在大黃魚(Larimichthys crocea)中, 磷蝦粉替代魚粉的比例不超過12.4%時, 其體重和特定生長率與對照組無顯著差異[16]。南極磷蝦粉替代魚粉比例不超過10%對黃顙魚的生長以及存活率影響不顯著[7]。而在圓斑星鰈中發(fā)現(xiàn), 磷蝦粉替代10%—30% 魚粉能夠顯著提高其生長性能[12]。同樣在黑鯛幼魚中, 當磷蝦粉替代20%—30%的魚粉時, 其增重明顯上升, 而當磷蝦粉替代魚粉比例高于40%時, 其增重率與對照組差異不顯著[17]。在本研究中, 當磷蝦粉替代魚粉水平不超過20%時黃鱔的增重率和特定生長率與對照魚粉組無顯著性差異, 但隨著磷蝦粉替代比例的增加, 黃鱔的增重率呈下降趨勢。其原因可能是南極磷蝦粉中含有一定比例的幾丁質(zhì), 幾丁質(zhì)增多會引起動物腸道的損傷, 從而影響飼料在魚體內(nèi)的消化吸收[18]。另外, 磷蝦粉中含有的氟積累過量也會對魚體產(chǎn)生一定的毒害[19]。在本實驗條件下, 結(jié)合雌性黃鱔生長性能以及飼料效率等指標的分析, 飼料中南極磷蝦粉替代魚粉的比例不宜超過20%。

形體指標在一定程度上可以反映魚類機體的營養(yǎng)健康狀況[20]。在三倍體虹鱒[11]中的研究結(jié)果表明磷蝦粉替代8.55%—57.02%魚粉對虹鱒的形體指標無顯著性影響。在黃鱔[8]中結(jié)果表明飼料中添加57.6—115.2 g/kg磷蝦粉對黃鱔臟體比存在顯著影響, 但對肥滿度和肝體比則無顯著性影響。這與本實驗的研究結(jié)果部分相一致。在本實驗中, 替代水平對黃鱔的肥滿度無顯著影響, 但卻顯著影響雌鱔肝體比和臟體比, 具體原因有待進一步探討。

3.2 南極磷蝦粉替代魚粉對魚體體成分的影響

飼料原料的組成能夠顯著影響魚體體成分[21]。在不同魚類南極磷蝦粉替代魚粉的研究中, 對魚體體成分的測定所得結(jié)果不相一致。大菱鲆(Scophthalmus maximus)的研究結(jié)果表明不同的南極磷蝦粉替代水平對魚體肌肉營養(yǎng)成分無顯著影響[22], 而點帶石斑魚(Epinephelus coioides)幼魚的脂質(zhì)水平隨著磷蝦粉添加水平升高而顯著提升[23]。在黃顙魚中, 隨著磷蝦粉替代水平的提高, 其魚體粗蛋白質(zhì)含量顯著下降, 同時還影響肌肉質(zhì)構(gòu)以及氨基酸的含量[7]。當磷蝦粉替代水平超過40%時, 大西洋鮭(Salmo Salar)肌肉中粗蛋白質(zhì)水平隨著添加比例升高而降低, 低于40%時肌肉中粗蛋白質(zhì)水平顯著升高[24]。在本研究中, 南極磷蝦粉替代20%魚粉時能夠顯著提高黃鱔肌肉粗蛋白質(zhì)含量, 但隨著替代水平的升高, 粗蛋白含量呈下降趨勢, 該結(jié)果與圓斑星鰈幼魚[25]及大西洋鮭[26]中的結(jié)果較為相似。肌肉中粗蛋白含量隨著磷蝦粉添加水平的提高而逐漸下降, 推測可能的原因是由于含磷蝦粉的飼料中幾丁質(zhì)、殼聚糖等的升高, 降低了營養(yǎng)物質(zhì)在魚體內(nèi)的消化吸收[25]。

性腺營養(yǎng)成分關(guān)系著性腺的發(fā)育狀況, 其中性腺中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)是保證性腺中卵子的充分發(fā)育以及產(chǎn)卵后受精、孵化以及仔魚質(zhì)量的關(guān)鍵因素。在本研究中, 當南極磷蝦粉替代魚粉比例超過60%時, 黃鱔卵巢組織中的粗蛋白及粗脂肪含量均呈下降趨勢, 而水分含量則顯著上升。這可能也是由于磷蝦粉高替代水平下飼料中的幾丁質(zhì)和氟含量增多,影響了魚體對營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運吸收。

3.3 南極磷蝦粉替代魚粉對雌性黃鱔抗氧化及非特異性免疫能力的影響

已有研究表明, 南極磷蝦粉富含的蝦青素可在一定程度上提高水產(chǎn)動物的抗氧化能力[27]。SOD是機體清除自由基的關(guān)鍵酶, 而MDA是自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應的最終產(chǎn)物, 其與CAT酶活性一起可綜合評價水產(chǎn)動物的抗氧化能力。Wei等[10]在大黃魚的研究中表明, 添加南極磷蝦粉替代魚粉對大黃魚肝臟組織中的SOD、MDA活性無顯著差異, 但總體趨勢隨著替代水平的上升其活性逐漸下降。在黃鱔中, SOD酶活性在一定的磷蝦粉替代比例內(nèi)顯著升高, 但隨著替代水平的上升而逐漸下降[8]。在本實驗中, 20%磷蝦粉替代魚粉不影響雌性黃鱔肝臟中SOD、MDA以及CAT的活性; 但是隨著磷蝦粉替代水平的升高, SOD活性顯著降低, 而MDA含量顯著升高。其原因可能是由于磷蝦粉高替代水平條件下飼料中的幾丁質(zhì)和氟含量的增加使魚體處于應激狀態(tài), 其體內(nèi)的自由基顯著增加而導致氧化應激, 影響了細胞正常功能的發(fā)揮, 從而降低了抗氧化能力。

水生動物的特異性免疫機制不具備抗體生成的二次反應, 非特異性免疫在水生動物的免疫防御中扮演著最為重要的角色[12]。在本實驗中, 黃鱔肝臟中的AKP活性、C4、IgM含量在對照組與20%磷蝦粉替代組之間無顯著性差異, 但AKP隨著替代水平的升高而顯著上升, 而C4、IgM含量隨著替代水平的升高逐漸下降。這些結(jié)果表明, 當磷蝦粉替代魚粉比例不超過20%時不影響黃鱔的非特異性免疫能力, 而過高水平的磷蝦粉替代會引起黃鱔非特異性免疫能力的下降。

3.4 南極磷蝦粉替代魚粉對黃鱔生殖力的影響

南極磷蝦粉中含有豐富的磷脂(極性脂)和蝦青素(非極性脂), 能夠提高魚類的繁殖性能[4,28—30]。研究表明, 飼料中添加一定比例的蝦青素可顯著提高大西洋鱈(Gadus morhuaL.)的卵子以及仔魚質(zhì)量[9]。在黃尾鰤(Seriola quinqueradiata)親魚培育階段的餌料中添加10%磷蝦粉可提高黃尾鰤親魚卵子質(zhì)量。在半滑舌鰨親魚培育飼料中添加一定比例的磷蝦粉, 能夠顯著提高半滑舌鰨血清中雌二醇含量以及相對產(chǎn)卵量, 但性腺成熟系數(shù)卻低于對照組[15]。在凡納濱對蝦添加南極磷蝦粉替代10%—20%的魚粉, 可促使凡納濱對蝦性腺指數(shù)升高, 在一定程度上影響其繁殖力[30]。在本研究結(jié)果中, 20%組雌性黃鱔的血清雌二醇含量以及相對懷卵量與對照組無顯著性差異, 但顯著高于其他高水平替代組。當磷蝦粉替代水平超過80%時, 雌性黃鱔的性腺指數(shù)顯著下降。這說明飼料中磷蝦粉添加過量可能導致過多的氟積累,從而降低魚體機體的性腺發(fā)育遲緩以及懷卵量下降。另外, 隨著磷蝦粉替代水平的提高, 雌性黃鱔的卵徑逐漸增大, 這可能是由于卵巢中水分含量隨著磷蝦粉替代水平的提高而增加, 從而使得卵徑增大。

4 結(jié)論

當磷蝦粉替代魚粉比例為20%時, 雌性黃鱔的生長性能、卵巢營養(yǎng)成分、肝臟抗氧化及非特異性免疫能力、個體生殖力均沒有受到顯著影響。當飼料中磷蝦粉替代魚粉比例達到40%以上時雌性黃鱔的生長、生殖等相關(guān)性能顯著降低。因此,在雌性黃鱔飼料中南極磷蝦粉替代魚粉的比例不宜超過20%。