陳文雅(通信作者)，王明泉，高晶晶

泉州市第一醫(yī)院輸血科 (福建泉州 362000)

新生兒溶血病(hemolytic disease of the newborn，HDN)特指由于母嬰之間的血型不合所引發(fā)的胎兒或新生兒紅細(xì)胞遭受破壞的一種免疫性溶血性疾病[1]，其主要臨床癥狀及體征為不同程度的黃疸、水腫、貧血、肝脾腫大，嚴(yán)重者可繼發(fā)膽紅素腦病，即核黃疸。核黃疸的病死率達(dá)70%，即便患兒存活下來，也會(huì)遺留運(yùn)動(dòng)障礙、智力不全等后遺癥[2]。在過去幾十年中，得益于抗-D免疫球蛋白在RhD新生兒溶血病(RhD-HDN)免疫預(yù)防中的成功應(yīng)用，因RhD引發(fā)的妊娠期異體免疫發(fā)生率得到大幅度下降，HDN的模式也發(fā)生了轉(zhuǎn)變，ABO血型系統(tǒng)不合及其他非D型同種異型抗體已成為許多發(fā)達(dá)國家發(fā)生HDN的最主要原因[3]。中國作為發(fā)展中國家，以ABO血型系統(tǒng)不合(約占85.3%)最為常見，其次為Rh血型系統(tǒng)不合(約占14.6%)[4]。眾所周知，ABO新生兒溶血病(ABO-HDN)的臨床癥狀較輕，絕大多數(shù)患兒僅表現(xiàn)為黃疸，少數(shù)患兒可出現(xiàn)貧血、水腫等癥狀[5]；但也有文獻(xiàn)[6-7]報(bào)道過因ABO-HDN引發(fā)較為嚴(yán)重的溶血病病例，部分患兒需采取換血治療，這也提醒我們，ABO-HDN并不總是輕癥，也需臨床多給予關(guān)注與重視。本研究通過分析我院收治的484例疑似ABO-HDN患兒的血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及臨床病歷資料，旨在了解ABO-HDN的發(fā)生分布情況，探討該病的相關(guān)影響因素，以期為ABO-HDN的早期診斷提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2021年11月在我院順利分娩的484對(duì)符合條件的母嬰為研究對(duì)象。母親年齡17～46歲，平均(30.04±4.60)歲；患兒進(jìn)行溶血三項(xiàng)檢測(cè)時(shí)的日齡為10 h至36 d，平均(4.91±4.85)d；出生體質(zhì)量1 800～4 250 g，平均(3 190.46±438.49)g；其中，男患兒246例，女患兒238例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：母嬰ABO血型不合；母嬰RhD均為陽性；母親血型不規(guī)則抗體篩查結(jié)果呈陰性；母嬰雙方病歷資料均完整；單胎妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕婦既往有輸血史；孕婦有自身免疫性溶血性疾病或其他溶血性疾??；新生兒患有除ABO-HDN之外的其他溶血性疾病。

1.2 儀器與試劑

所使用的儀器與試劑包括全自動(dòng)血型/配血系統(tǒng)分析儀、卡式離心機(jī)、ABO-Rh血型檢測(cè)卡、抗人球蛋白檢測(cè)卡、人ABO血型反定型用紅細(xì)胞測(cè)定試劑盒、紅細(xì)胞血型抗體篩選細(xì)胞，均由Diagnostic Grifols,S.A.配套提供；FYQ型試劑卡孵育器由長(zhǎng)春博研科學(xué)儀器有限責(zé)任公司提供，Baso微電腦控制血庫專用離心機(jī)由臺(tái)灣貝索生物技術(shù)有限公司提供，酸放散試劑盒由長(zhǎng)春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1血型與不規(guī)則抗體篩查的檢測(cè)

ABO血型、Rh(D)血型及血型不規(guī)則抗體篩查均由Diana全自動(dòng)血型/配血系統(tǒng)分析儀進(jìn)行全自動(dòng)化檢測(cè)。

1.3.2溶血三項(xiàng)檢測(cè)

(1)直接抗人球蛋白試驗(yàn)：向抗人球蛋白檢測(cè)卡反應(yīng)孔內(nèi)加入50 μl患兒的紅細(xì)胞懸液(濃度為1%)，離心(1 100 r/min)處理9 min后判讀結(jié)果。(2)游離抗體試驗(yàn)：向已標(biāo)記好的抗人球蛋白檢測(cè)卡各反應(yīng)孔內(nèi)加入50 μl血型抗體篩選紅細(xì)胞試劑、ABO血型反定型用紅細(xì)胞試劑，再向各反應(yīng)孔內(nèi)加入25 μl患兒血清，以37 ℃孵育15 min，離心(1 100 r/min)處理9 min后判讀結(jié)果。(3)抗體放散試驗(yàn)：使用0.9%氯化鈉注射液洗滌患兒紅細(xì)胞3遍，最后1遍的洗滌液留取作為對(duì)照；嚴(yán)格按照酸放散試劑盒的使用說明書操作制備放散液，向已標(biāo)記好的抗人球蛋白檢測(cè)卡各反應(yīng)孔內(nèi)加入50 μl血型抗體篩選紅細(xì)胞試劑、ABO血型反定型用紅細(xì)胞試劑，再向各反應(yīng)孔內(nèi)加入25 μl上述制備好的放散液和對(duì)照液，以37 ℃孵育15 min，最后離心(1 100 r/min)處理9 min后判讀結(jié)果。

1.4 ABO-HDN診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]

(1)母嬰之間存在ABO血型不合。(2)抗體放散試驗(yàn)為診斷ABO-HDN的金標(biāo)準(zhǔn)，只要抗體放散試驗(yàn)為陽性，即可診斷為ABO-HDN；抗體放散試驗(yàn)為陰性，而直接抗人球蛋白試驗(yàn)和(或)游離抗體試驗(yàn)為陽性，則為可疑ABO-HDN；三項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均為陰性，則不可診斷為ABO-HDN。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Excel 2016建立數(shù)據(jù)庫，使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，樣本率間的比較采用χ2檢驗(yàn)，單向有序R×2表資料的研究目的若為分析樣本率與等級(jí)分層變量之間是否存在線性變化趨勢(shì)，則采用線性趨勢(shì)卡方檢驗(yàn)；多因素分析采用Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 484份溶血三項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果

484份疑似ABO-HDN患兒的標(biāo)本，共檢測(cè)出陽性標(biāo)本321份，其中，305例被確診為ABO-HDN，其余16例被判定為可疑ABO-HDN；321份陽性標(biāo)本中，主要檢出組合為三項(xiàng)試驗(yàn)均陽性、游離抗體試驗(yàn)和抗體放散試驗(yàn)雙陽性及抗體放散試驗(yàn)單陽性，占87.54%(281/321)；305例確診患兒中，直接抗人球蛋白試驗(yàn)檢出127例(占41.64%)，游離抗體試驗(yàn)檢出218例(占71.48%)，抗體放散試驗(yàn)檢出305例(占100%)，見表1。

表1 484份溶血三項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果分布情況

2.2 不同母嬰ABO血型不合組合的ABO-HDN陽性率情況

母親為O型的患兒(O-A、O-B)ABO-HDN陽性率為72.88%(301/413)，母親為非O型的患兒(A-AB、A-B、B-A、B-AB)ABO-HDN陽性率為5.63%(4/71),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=117.558，P<0.05)；母親為O型、患兒為A型或B型的ABO-HDN陽性率分別為59.88%、81.27%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=22.809，P<0.05)，見表2。

表2 不同母嬰ABO血型不合組合的ABO-HDN發(fā)生分布情況

2.3 送檢日齡對(duì)ABO-HDN檢出率的影響

不同送檢日齡的ABO-HDN檢出率不完全相同(χ2=61.343，P<0.05)；而且，經(jīng)線性趨勢(shì)卡方檢驗(yàn)顯示，隨著送檢日齡的推遲，ABO-HDN檢出率呈線性下降趨勢(shì)(χ2=59.249，P<0.05)，見表3。

表3 不同送檢日齡分組的ABO-HDN檢出分布情況

2.4 患兒發(fā)生ABO-HDN的單因素分析

經(jīng)單因素分析顯示，ABO-HDN的發(fā)生可能受母親妊娠次數(shù)、患兒性別及出生體質(zhì)量的影響(P<0.05)；不受母親年齡的影響(P>0.05)，見表4。

表4 患兒發(fā)生ABO-HDN的單因素分析[例(%)]

2.5 患兒發(fā)生ABO-HDN的多因素分析

以單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響因素為自變量進(jìn)行賦值(見表5)，通過二項(xiàng)Logistic回歸分析顯示，母親妊娠次數(shù)≥2次、女患兒、出生體質(zhì)量≥3 000 g是ABO-HDN發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表6。

表5 自變量賦值情況

表6 患兒發(fā)生ABO-HDN的多因素分析

3 討論

ABO-HDN的發(fā)生源于胎兒從父方遺傳到母方所缺乏的A型或B型抗原，導(dǎo)致母嬰ABO血型不合，一旦胎兒的紅細(xì)胞通過胎盤進(jìn)入到母體中，即有可能對(duì)母體形成免疫刺激，產(chǎn)生相應(yīng)的IgG抗體；IgG抗體作為唯一能通過胎盤的抗體類型，再借助胎盤反向進(jìn)入胎兒體內(nèi)，致敏胎兒紅細(xì)胞，并激活單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，釋放大量溶酶體酶，破壞胎兒紅細(xì)胞，最后造成溶血[9]。ABO-HDN在胎兒時(shí)期溶血所產(chǎn)生的多余膽紅素可經(jīng)胎盤由母體代為清除，出生后溶血仍在繼續(xù)，但新生兒相對(duì)不成熟的肝臟系統(tǒng)無法清除過量的膽紅素，因而造成新生兒高膽紅素血癥，而皮膚黃染等征象一般于新生兒出生后2～3 d才逐漸顯現(xiàn)[10-11]。鑒于ABO-HDN的臨床表現(xiàn)相對(duì)滯后于其真實(shí)病情，為了避免因延遲診斷和治療給患兒健康造成損害，提升ABO-HDN的早期診斷能力尤為重要。

溶血三項(xiàng)檢測(cè)是目前國內(nèi)診斷ABO-HDN最主要的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。本研究結(jié)果顯示，溶血三項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果顯示，484例疑似ABO-HDN患兒中，305例被確診為ABO-HDN，確診率達(dá)63.02%(305/484)，與尹明偉等[12]報(bào)道的69.97%確診率相近。主要陽性檢出模式集中分布于三項(xiàng)試驗(yàn)均陽型、游離抗體試驗(yàn)和抗體放散試驗(yàn)雙陽性及抗體放散試驗(yàn)單陽性這三種組合，占87.54%。在305例確診病例中，直接抗人球蛋白試驗(yàn)檢出127例(占41.64%)，游離抗體試驗(yàn)檢出218例(占71.48%)，抗體放散試驗(yàn)檢出305例(占100%)?？梢?，抗體放散試驗(yàn)的靈敏度最高，直接抗人球蛋白試驗(yàn)的靈敏度最低。直接抗人球蛋白試驗(yàn)與抗體放散試驗(yàn)均為檢測(cè)患兒紅細(xì)胞是否被IgG抗體致敏的試驗(yàn)，但由于在新生兒時(shí)期，機(jī)體ABO抗原表達(dá)量?jī)H為成人的25%～50%，導(dǎo)致可結(jié)合于患兒紅細(xì)胞上的IgG抗體相對(duì)有限，因此易造成直接抗人球蛋白試驗(yàn)出現(xiàn)假陰性的結(jié)果[13]；抗體放散試驗(yàn)則相當(dāng)于直接抗人球蛋白試驗(yàn)的放大試驗(yàn)，利用比直接抗人球蛋白試驗(yàn)多出幾百倍紅細(xì)胞的量，通過酸放散等方法將致敏于紅細(xì)胞上的IgG抗體洗脫下來，因而獲得含有高滴度IgG抗體的放散液，從而提升了試驗(yàn)的靈敏度[14]。當(dāng)然，有關(guān)ABO-HDN的診斷不能單純依靠溶血三項(xiàng)檢測(cè)，還需完善其他相關(guān)輔助性檢查，并結(jié)合患兒臨床表現(xiàn)進(jìn)行綜合分析。有文獻(xiàn)指出[15]，網(wǎng)織紅計(jì)數(shù)、臍帶血總膽素或早期總膽紅素(產(chǎn)后第6小時(shí))及產(chǎn)前母體IgG抗-A(B)滴度等有助于ABO-HDN的早期診斷。由于本研究為回顧性調(diào)查，在資料收集上有一定的局限性，故可出現(xiàn)部分檢查缺失、檢測(cè)時(shí)間不統(tǒng)一或檢測(cè)方法不一致等情況，導(dǎo)致未能綜合分析其他輔助檢查與溶血三項(xiàng)檢測(cè)相結(jié)合對(duì)ABO-HDN早期診斷的臨床應(yīng)用價(jià)值。

通過對(duì)母親是否為O型的患兒進(jìn)行分組比較后我們發(fā)現(xiàn)，母親為O型的ABO-HDN陽性率高達(dá)72.88%，母親為非O型的ABO-HDN陽性率僅為5.63%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果說明，ABO-HDN高發(fā)于O型產(chǎn)婦所分娩的非O型新生兒；母嬰血型為O-A、O-B的患兒ABO-HDN陽性率分別為59.88%、81.27%，顯然，B型患兒的陽性率高于A型患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，該結(jié)果與Bel Hadj等[16]和陳陸飛等[17]的研究結(jié)果相一致，但與楊愛月等[18]和李彥美等[19]的研究結(jié)果不一致。有關(guān)A型、B型患兒ABO-HDN陽性率的比較，不同的研究得出的結(jié)果截然不同，筆者分析其原因可能與不同地區(qū)ABO血型的分布存在差異有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)送檢日齡為0～2 d時(shí)，ABO-HDN檢出率高達(dá)82.66%；但隨著送檢日齡的推遲，ABO-HDN檢出率呈逐步下降的趨勢(shì)。這主要考慮隨著產(chǎn)婦病情進(jìn)展，被致敏患兒的紅細(xì)胞不斷被機(jī)體識(shí)別破壞，游離于血漿中的IgG抗體也不斷被機(jī)體中的血型抗原物質(zhì)所中和消耗，從而導(dǎo)致檢出率逐步下降[20]。這也提示我們，應(yīng)盡快對(duì)可疑ABO-HDN患兒進(jìn)行溶血三項(xiàng)檢測(cè)，以免因假陰性結(jié)果而延誤治療；同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)送檢日齡≥7 d時(shí)，仍有32.39%的檢出率，提示日齡超7 d的患兒依然有進(jìn)行檢測(cè)的意義，但也需警惕，其存在假陰性率較高的風(fēng)險(xiǎn)。需要注意的是，送檢日齡在一定程度上也受臨床醫(yī)師對(duì)疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的影響，越是早期送檢，面臨的臨床預(yù)估風(fēng)險(xiǎn)往往越大，這也可能是早期送檢檢出率偏高的原因之一?；谌正g對(duì)ABO-HDN檢出率的影響，筆者提議，留取新生兒臍帶血樣本進(jìn)行血型鑒定和溶血三項(xiàng)檢測(cè)等檢測(cè)，不僅有助于ABO-HDN的早期診斷，而且可減少有創(chuàng)操作對(duì)患兒造成的損傷。早在2015年，意大利1份有關(guān)預(yù)防和治療HDN的建議書中就曾提出，對(duì)所有新生兒臍帶血樣本進(jìn)行直接抗人球蛋白試驗(yàn)檢測(cè)，若試驗(yàn)呈陽性，再進(jìn)行抗體放散試驗(yàn)檢測(cè)[21]。結(jié)合我國國情，對(duì)所有新生兒進(jìn)行普遍篩查顯然是不切實(shí)際的，但可通過制定ABO-HDN風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，針對(duì)達(dá)到中高風(fēng)險(xiǎn)的新生兒進(jìn)行常規(guī)篩查。

兩項(xiàng)Logistic回歸分析顯示，母親妊娠次數(shù)≥2次、女患兒、出生體質(zhì)量≥3 000 g是ABO-HDN發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。由于自然界廣泛存在與A、B型抗原相類似的物質(zhì)(如植物、寄生蟲、細(xì)菌、傷寒疫苗、破傷風(fēng)及白喉類毒素等)，若母親在首次妊娠前接觸到這類物質(zhì)，即有可能免疫刺激母體，產(chǎn)生IgG抗-A(B)抗體，因此，ABO-HDN可發(fā)生于第一胎[22]，且伴隨著母親妊娠次數(shù)的增加，胎兒紅細(xì)胞再次進(jìn)入母體的概率也隨之增加；與初次免疫應(yīng)答不同的是，再次免疫應(yīng)答只要接觸到小劑量的抗原，便可快速產(chǎn)生大量且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的IgG抗體，誘發(fā)ABO-HDN發(fā)生，因此，妊娠史可增加ABO-HDN的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[23]。有關(guān)出生體質(zhì)量對(duì)ABO-HDN發(fā)生的影響，考慮可能為出生體質(zhì)量≥3 000 g的患兒ABO血型抗原發(fā)育相對(duì)于出生體質(zhì)量<3 000 g的患兒成熟，這更有利于IgG抗-A(B)抗體致敏于紅細(xì)胞上，故而增加了發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[24]；至于女患兒更易發(fā)生ABO-HDN，考慮其原因可能與患兒雌激素水平有關(guān)；據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[25]，雌激素有增強(qiáng)免疫反應(yīng)的作用。

綜上所述，溶血三項(xiàng)檢測(cè)對(duì)ABO-HDN的診斷具有重要價(jià)值；其中，抗體放散試驗(yàn)具有高靈敏度的特征。鑒于送檢日齡對(duì)ABO-HDN檢出率的影響，針對(duì)可疑ABO-HDN的患兒，應(yīng)盡早進(jìn)行溶血三項(xiàng)檢測(cè)，以免因漏診而延誤治療；同時(shí)，筆者也提倡，應(yīng)合理完善產(chǎn)前關(guān)于ABO-HDN的輔助性檢查，如夫婦血型鑒定、母體IgG抗-A(B)滴度及IgG亞型測(cè)定、母體外周血游離胎兒DNA(cff-DNA)血型基因檢測(cè)、胎兒大腦中動(dòng)脈峰值流速(MCA-PSV)多普勒檢測(cè)等，綜合考量產(chǎn)前檢測(cè)及相關(guān)危險(xiǎn)因素的影響，制定ABO-HDN風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[26, 27]。對(duì)達(dá)到中高風(fēng)險(xiǎn)的新生兒，應(yīng)留取臍帶血樣進(jìn)行血型鑒定、溶血三項(xiàng)檢測(cè)、網(wǎng)織紅計(jì)數(shù)和總膽紅素測(cè)定，以實(shí)現(xiàn)早診斷早治療，保障患兒生命健康。