周小紅，李寧康，黑云鵬，包樹臻，宮德瀛，高 慧，?？巳?/p>

心搏驟停(CA)是指心臟射血功能突然終止、大動脈搏動與心音消失、重要器官嚴(yán)重缺血缺氧，從而導(dǎo)致生命終止的臨床綜合征。心肺復(fù)蘇(CPR)是心搏驟停的首選治療方法，但組織缺血一段時間，當(dāng)血流重新恢復(fù)后細胞代謝障礙與結(jié)構(gòu)破壞反較缺血時進一步加劇，器官功能進一步惡化而造成多器官組織缺血-再灌注損傷(IRI)，可以引起全身炎癥反應(yīng)和血液高凝[1]。腎臟由于其組織功能及結(jié)構(gòu)的特殊性，是對IRI敏感的器官之一，因此在心肺復(fù)蘇后容易發(fā)生腎功能障礙。臨床工作中 12% ～ 13% 的心跳驟?？沙霈F(xiàn)腎臟功能衰竭，其死亡率高達 50%，故研究CPR后的腎臟衰竭防治具有重要臨床意義[2]。單酰甘油脂肪酶(MAGL)是內(nèi)源性大麻素(ECS)水解酶，特異水解2-花生四烯酸甘油(2-AG)[3]，同時2-AG在MAGL作用下很快代謝為花生四烯酸(AA)，AA在COX2作用下代謝為血栓素B2(TXB2)、前列腺素E2(PGE2)和前列腺素D2(PGD2)等。本文采用 Laurance Kates[4]大鼠CA模型，研究內(nèi)源性大麻素水解酶抑制URB602對花生四烯酸代謝產(chǎn)物和內(nèi)源性大麻素含量的影響，為CPR后的腎臟保護治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料:清潔級雄性SD大鼠26只由四川達碩生物科技有限公司提供，合格證號為SCXK(川)2013-30。隨機分為3組，Sham組6只，CPR組、CPR+URB602組各10只。Sham組不建立心肺復(fù)蘇模型，只做氣管插管和股動靜脈穿刺術(shù)；CPR組與 CPR+URB602組建立心肺復(fù)蘇模型，CPR+URB602組復(fù)蘇后1 min給予URB602。實驗前 12 h禁食不禁水，戊巴比妥鈉腹腔注射，麻醉完善后建立心肺復(fù)蘇模型。實驗通過四川大學(xué)動物倫理委員會審核(Protocol # 2016042)。

1.2 動物建模：根據(jù)Laurence Katz等[5]報道大鼠CA-CPR模型鑒定標(biāo)準(zhǔn),評價CA-CPR模型[5]的成功(心電圖顯示心電靜止、室顫、心電機械分離；心尖區(qū)心臟搏動消失；動物口唇黏膜明顯發(fā)紺；MAP ≤10 mmHg)，見圖1(目錄后)。窒息8 min后開放夾閉的氣管導(dǎo)管，立即心肺復(fù)蘇及吸入100%氧氣進行機械通氣，用中指和食指在劍突上一橫指處，按壓深度為胸廓前后徑三分之一，按壓頻率200 次/min左右，所有動物按壓由一人完成。自主循環(huán)恢復(fù)ROSC定義為心電圖出現(xiàn)正常的QRS波群(夾閉氣管前的心電圖表現(xiàn))；可觸摸到明顯的心臟搏動，皮膚黏膜發(fā)紺改善；平均動脈壓大于60 mmHg以上，維持10 min時視為自主循環(huán)恢復(fù)。如行CRP 5 min以上而未有ROSC，則視為CPR失敗，放棄復(fù)蘇。

1.3 檢測指標(biāo)和組織制備:①自主循環(huán)恢復(fù)后6 h取腎臟組織，液氮冷凍后快速放入-80℃冰箱凍存，批量檢測2-AG以及TXB2、PGE2和PGD2含量；②自主循環(huán)恢復(fù)后6 h 開胸心臟取血1 mL,在低溫下3 000 r/min離心，血清分裝后批量檢測尿素氮(BUN)gng 肌酐(Cr)含量。

1.4 檢測方法[6]

1.4.1 花生四烯酸代謝產(chǎn)物和ECS含量檢測:①標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。100 μL 0.1%甲酸水溶液中分別加入10 μL工作溶液、10 μL混合內(nèi)標(biāo)(d4-AEA50 ng/mL,PEA-d4 200 ng/mL,2-AG-d5 34 μg/mL,AA-d8 15 μg/mL)，混勻后加入200 μL乙酸乙酯-正己烷(9∶1)萃取，8 000 r/min 4 ℃離心10 min，收集上層有機相液；下層再加入200 μL乙酸乙酯-正己烷(9∶1)萃取，離心，合并有機相，在氮氣下吹干，殘余物用100 μL乙腈復(fù)溶，20 000 r/min離心15 min后進樣測定。②稱取組織50 mg，冰浴下剪碎，依次加入100 μL冰上預(yù)冷的0.1%甲酸水溶液、磁珠2～3顆，10 μL混合內(nèi)標(biāo)、200 μL 乙酸乙酯-正己烷(9∶1)，用磁珠勻漿儀勻漿30 s，8 000 r/min 4 ℃離心10 min，收集上層有機相液；下層再加入200 μL乙酸乙酯-正己烷(9∶1)萃取，離心，合并有機相，在氮氣下吹干，殘余物用100 μL 乙腈復(fù)溶，20 000 r/min離心15 min后進樣測定。③用Agilent 1260-6460高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測。

1.4.2 腎臟功能檢測：取出凍存的血清室溫下復(fù)融，取400 μL全自動生化分析儀檢測BUN和Cr含量 (mindray BS-120,China)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠自主循環(huán)恢復(fù)情況：20只大鼠自主循環(huán)恢復(fù)18只，其中CPR組和CPR+URB602組各9只自主循環(huán)恢復(fù)，CPR組有6只存活6 h，CPR+URB602組有8只存活6 h。

2.2 復(fù)蘇后各組大鼠基礎(chǔ)數(shù)值比較:各組大鼠在體重、MAP、HR復(fù)蘇前差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。所有死亡動物尸體解剖后未發(fā)現(xiàn)明顯異常，見表1。

表1 3組大鼠基礎(chǔ)數(shù)值比較

2.3 2組大鼠自主循環(huán)恢復(fù)時間：CPR組合和CPR+URB602組大鼠自主循環(huán)恢復(fù)時間分別為(70±15)s和(69±17)s，2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 各組大鼠復(fù)蘇后腎臟功能改變：CPR組和CPR+URB602組大鼠在ROSC后6 h BUN和Cr含量和Sham組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但CPR組BUN和Cr含量較CPR+URB602組有所上升(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠腎臟功能比較

2.5 復(fù)蘇后各組大鼠腎臟2-AG、AEA、AA、TXB2、PGE2和PGD2含量比較:與Sham組相比，CPR+URB602組和CPR組在ROSC后6 h的2-AG 、AEA、AA、TXB2、PGE2、PGD2 均升高，CPR組AA、TXB2、PGE2、PGD2 較CPR+URB602組升高更明顯(P<0.05)，但CPR+URB602組2-AG升高更明顯(P<0.05)，見圖1(目錄后)。

3 討論

本試驗結(jié)果提示復(fù)蘇后6 h,內(nèi)源性大麻素干預(yù)組存活大鼠多于常規(guī)復(fù)蘇組，并且復(fù)蘇后大鼠出現(xiàn)內(nèi)源性大麻素水平增高，AA及其代謝產(chǎn)物含量增高。給予URB602后AA及其代謝產(chǎn)物含量降低。2個復(fù)蘇組BUN和Cr數(shù)值較Sham組有升高，且未給URB602組的大鼠升高的更明顯，提示內(nèi)源性大麻素可能通過降低AA及其代謝產(chǎn)物含量而保護腎臟功能，進而使得復(fù)蘇后6 h 存活大鼠數(shù)量增多。在臨床試驗中發(fā)現(xiàn)，CA后復(fù)蘇成功患者復(fù)蘇早期即存在腎功能改變，多在1～3 d內(nèi)表現(xiàn)最為明顯[8]。動物實驗證明,CA-CPR后腎功能損害持續(xù)時間長，在復(fù)蘇后120 h可能再次出現(xiàn)腎功能損害[9]。本研究雖然存活6 h的大鼠并沒有發(fā)現(xiàn)腎臟功能的明顯損傷，但其可能原因是檢測的兩項指標(biāo)還不夠敏感，不能反映早期腎臟的損傷，也可能是因為由于腎臟有較強的代償功能，腎臟損傷所表現(xiàn)出的時間一般比心臟損傷出現(xiàn)的晚一些[7]。

心肺復(fù)蘇過程實質(zhì)上是全身缺血-再灌注的過程，可引發(fā)各種炎性介質(zhì)釋放及凝血障礙(血液高凝),血液高凝進一步導(dǎo)致組織微循環(huán)障礙和內(nèi)皮損傷[1]。腎臟由于其組織功能及結(jié)構(gòu)的特殊性，是對缺血-再灌注敏感的器官之一。腎缺血-再灌注損傷是缺血性急性腎功能衰竭的重要損傷環(huán)節(jié)。腎臟為高灌注器官，對缺血及缺血后再灌注均較敏感，造成缺血-再灌注損傷的相關(guān)因素很多，涉及眾多機制。而腎臟炎性介質(zhì)釋放和凝血障礙癥反應(yīng)介質(zhì)釋放是腎臟損傷的重要機制。缺血-再灌注時激活中性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞、淋巴細胞等炎癥細胞，參與腎缺血-再灌注損傷[10]。再灌注損傷后炎癥反應(yīng)發(fā)生的一個早期先決條件是局部化學(xué)趨化因子的表達。腎臟對缺血非常敏感，腎缺血時首先影響血管內(nèi)皮細胞，內(nèi)皮細胞受損后，進而導(dǎo)致組織局部產(chǎn)生的一些炎性因子及炎癥介質(zhì)增加，包括細胞因子TNF-α、IL-1、補體活化產(chǎn)物、血小板激活因子、花生四烯酸的代謝產(chǎn)物以及活性氧代謝物等，它們可使黏附分子表達增強。炎性因子、炎性介質(zhì)及黏附分子作用于腎臟，可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡[11]。在本實驗中可以發(fā)現(xiàn)實驗組應(yīng)用內(nèi)源性大麻素水解酶抑制劑URB602后，AA及其代謝產(chǎn)物降低，而說明它有抗炎作用。在AA的降解產(chǎn)物中，TXA2是血小板內(nèi)具有重要生理功能的信息分子。血小板膜磷脂上AA經(jīng)環(huán)氧酶、血栓素合成酶代謝產(chǎn)生TXA2，它能反饋性地直接激活PLC，降低血小板內(nèi)cAMP水平并且誘導(dǎo)血小板聚集[12]。而URB602可以降低TXB2(TXA2不穩(wěn)定，很快代謝為TXB2)水平，改善血液高凝狀態(tài)，可能會改善微循環(huán)，進而保護腎臟，提高存活率。

單酰甘油脂肪酶[13]是ECS水解酶，特異水解2-AG為AA，AA又代謝為前列腺素和TXA2，TXA2不穩(wěn)定很快轉(zhuǎn)化為TXB2。2-AG能夠與大麻素受體1和大麻素受體2結(jié)合，產(chǎn)生類似大麻素的作用。本研究發(fā)現(xiàn)給予URB602后腎臟阻滯2-AG明顯升高，而AEA2組變化不明顯，說明URB602主要是MAGL水解酶抑制劑，通過減少2-AG降解而發(fā)揮作用。

總之，給予內(nèi)源性大麻素水解酶抑制劑后可以降低腎臟TXB2、PGE2和PGD2含量，對心肺復(fù)蘇腎臟保護有益處。