沈 樂，陳婭楠，耑 冰

《2020年全球癌癥統(tǒng)計報告》顯示，肺癌的全球發(fā)病率位居第二位，全球約有180萬肺癌死亡病例[1]，且中國肺癌發(fā)病率高于全球其他國家[2]。隨著人們健康意識的增強(qiáng)，醫(yī)療水平不斷提升，肺結(jié)節(jié)的檢出率明顯增高[3]。惡性肺結(jié)節(jié)為早期肺癌，病理診斷主要為I期。自噬現(xiàn)象是細(xì)胞內(nèi)噬菌體降解細(xì)胞內(nèi)折疊錯誤、老化蛋白質(zhì)及其自身受損細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，是真核細(xì)胞特有的代謝通路[4]。Beclin1蛋白主要誘導(dǎo)并啟動自噬過程，在自噬的溶酶體降解過程中起抑癌作用[5]。LC3蛋白是自噬特異的標(biāo)記物，可促進(jìn)自噬小體成熟，其表達(dá)能反映細(xì)胞自噬過程中的活性。本研究通過檢測Beclin1和LC3在惡性肺結(jié)節(jié)中的表達(dá)，探討B(tài)eclin1和LC3在惡性肺結(jié)節(jié)中的表達(dá)變化及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取2019年3月至2020年12月寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的惡性肺結(jié)節(jié)組織標(biāo)本40例，其中男性16例，女性24例，平均年齡(63.3±11.2)歲。病理類型分別為鱗癌4例、腺癌36例。同期手術(shù)切除癌旁組織30例(距肺癌邊緣3～5 cm)以及良性肺結(jié)節(jié)組織標(biāo)本18例作為對照組，所有患者均經(jīng)過病理學(xué)檢查確診。本研究經(jīng)寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑L：兔抗人Beclin1、LC3多克隆抗體和通用型免疫組化試檢測劑盒均來自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組化SP法:按SP法進(jìn)行免疫組化染色，實驗組織標(biāo)本用4%甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，5 μm厚切片，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。用已知Beclin1、LC3陽性的組織切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定:結(jié)果判定采用雙盲法，由兩位高年資病理科醫(yī)師觀察每張切片，在每張切片中隨機(jī)選擇5個高倍視野，其中每個視野觀察100個細(xì)胞。依據(jù)染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞比率分別進(jìn)行評估，最終得到綜合評定。染色強(qiáng)度評分，無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞比率評分，陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比率<10%為0分，11%～50%為1分，51%～80%為2分，>80%為3分。綜合評分[6]=染色強(qiáng)度評分×陽性細(xì)胞比率評分：0分為陰性(-)，1～4分為陽性(+/++)，>4分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件，自噬蛋白在良惡性肺結(jié)節(jié)及癌旁組織中的表達(dá)采用多組獨立樣本Kruskal-Wallis H秩和檢驗，與惡性肺結(jié)節(jié)臨床病理因素之間用相關(guān)性檢驗，自噬蛋白之間的相關(guān)性用Spearman等級相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自噬蛋白Beclin1和LC3在惡性肺結(jié)節(jié)的表達(dá)免疫組化結(jié)果:顯微鏡下觀察肺組織細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。所有切片均在同一放大倍數(shù)、同一光強(qiáng)度下分析。免疫組化結(jié)果顯示，自噬蛋白Beclin1和LC3陽性表達(dá)主要分布在肺泡上皮細(xì)胞，定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒狀，強(qiáng)陽性者細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也有著色，見圖1至圖2(目錄后)。

2.2 自噬蛋白Beclin1和LC3在良惡性肺結(jié)節(jié)及癌旁組織中的表達(dá):Beclin1在惡性肺結(jié)節(jié)、良性肺結(jié)節(jié)及癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為30.00%、43.33%、100.00%，LC3在惡性肺結(jié)節(jié)、良性肺結(jié)節(jié)及癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為27.50%、53.33%、100.00%。惡性肺結(jié)節(jié)中Beclin1和LC3的陽性表達(dá)率均低于良性肺結(jié)節(jié)和癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 Beclin1、LC3在良惡性肺結(jié)節(jié)及癌旁組織中的表達(dá)

2.3 自噬蛋白Beclin1和LC3的表達(dá)與惡性肺結(jié)節(jié)臨床病理因素的關(guān)系:Beclin1和LC3自噬蛋白的表達(dá)與惡性肺結(jié)節(jié)患者年齡的相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與性別、病理類型、TNM分期的相關(guān)性差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 40例惡性肺結(jié)節(jié)患者Beclin1、LC3蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

2.4 自噬蛋白Beclin1和LC3的相關(guān)性:Beclin1和LC3在惡性肺結(jié)節(jié)中的表達(dá)呈正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.452，P<0.05)，見表3。

表3 Beclin1與LC3在惡性肺結(jié)節(jié)中表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

自噬是真核細(xì)胞的再循環(huán)過程，通過在細(xì)胞內(nèi)降解衰老或破損細(xì)胞器、合成或折疊錯誤及老化的蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)細(xì)胞的代謝需求和細(xì)胞器的更新，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性和蛋白代謝平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵的功能[7-8]。自噬活性如長期受到抑制，可使得細(xì)胞內(nèi)的危害因素不斷積聚，其功能的降低會提高細(xì)胞的氧化應(yīng)激，加速致瘤性突變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時自噬隨著腫瘤惡性程度的增加而上調(diào)[9]。在腫瘤發(fā)展的早期，如阻礙自噬作用可導(dǎo)致癌前病變的發(fā)展，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的形成[10]。肺結(jié)節(jié)是一種病因不明的多系統(tǒng)多臟器的肉芽腫性病變，通常侵犯肺、雙側(cè)肺門淋巴結(jié)等器官，包括良性結(jié)節(jié)(非癌性)及惡性(癌性)結(jié)節(jié)，而惡性肺結(jié)節(jié)通常指肺內(nèi)惡性腫瘤，即早期肺癌，所以惡性肺結(jié)節(jié)的早發(fā)現(xiàn)及早治療對提高肺癌患者生存率和預(yù)后的改善至關(guān)重要[11]。Beclin1是哺乳動物細(xì)胞中唯一的特異性自噬基因，其位于人類染色體17q21上，作為啟動自噬的啟動因子，通過介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于吞噬泡，在自噬發(fā)生與成熟的過程中具有重大作用。有研究表明，Beclin1基因缺失及蛋白表達(dá)降低會引起惡性腫瘤的發(fā)生，卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中，Beclin1基因表達(dá)明顯降低，并且低于其相應(yīng)正常組織[12]。本研究結(jié)果顯示，Beclin1在惡性肺結(jié)節(jié)中的陽性表達(dá)率低于癌旁組織和良性肺結(jié)節(jié)，提示惡性肺結(jié)節(jié)中存在Beclin1蛋白表達(dá)下調(diào)，使得自噬活性下降，導(dǎo)致異常細(xì)胞持續(xù)增加，最終形成惡性肺結(jié)節(jié)。

本研究中，Beclin1和LC3的表達(dá)與患者年齡相關(guān)，與王文濤等[13]研究結(jié)果一致。LC3是Beclin1蛋白調(diào)控下游的關(guān)鍵基因，其表達(dá)水平與自噬活性密切相關(guān)，是檢測細(xì)胞自噬活性的特異性標(biāo)志物[14]。研究表明，LC3的異常表達(dá)與胃癌、肺癌、肝癌等的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示,惡性肺結(jié)節(jié)中LC3蛋白低表達(dá)，表達(dá)水平低于癌旁組織和良性肺結(jié)節(jié)，提示在惡性肺結(jié)節(jié)發(fā)生發(fā)展過程中，LC3表達(dá)缺失或下調(diào)降低了細(xì)胞自噬活性，增加了腫瘤易感性，促進(jìn)了惡性肺結(jié)節(jié)的發(fā)展。

自噬可促進(jìn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡、分化、發(fā)育和生存，是一種與維持細(xì)胞組織穩(wěn)態(tài)性相關(guān)的高度選擇性細(xì)胞清除途徑，即高度保守的生物學(xué)過程。對比相關(guān)研究患者年齡普遍偏高，本研究也以60歲以上患者居多，這可能與自噬活性改變有關(guān)。相關(guān)研究表明，隨著年齡的增長，自噬相關(guān)蛋白的活性也隨之降低，加速細(xì)胞損傷并促進(jìn)衰老相關(guān)疾病的發(fā)展[16]。

本研究結(jié)果表明，惡性肺結(jié)節(jié)中自噬蛋白Beclin1和LC3的陽性表達(dá)呈正相關(guān)性，與張秀義等[4]研究一致。Beclin1和LC3作為細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)通路的上下游靶點，二者低表達(dá)可使得細(xì)胞自噬活性降低，阻礙細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，導(dǎo)致惡性肺結(jié)節(jié)的發(fā)生，結(jié)果提示Beclin1和LC3蛋白聯(lián)合檢測對惡性肺結(jié)節(jié)治療及預(yù)后具有一定參考價值。

綜上所述，自噬蛋白Beclin1和LC3在惡性肺結(jié)節(jié)中低表達(dá)，細(xì)胞自噬活性的降低對惡性肺結(jié)節(jié)的發(fā)生發(fā)展具有一定作用。