張 燕，許華瑞，郭東更，高智達(dá)，李 靜，陳 莉

高危型人乳頭狀瘤病毒(HR-HPV) 持續(xù)性感染是宮頸癌前病變與宮頸癌發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。5%～10%的HPV感染女性患者無(wú)法通過(guò)自身免疫功能將其清除而導(dǎo)致HR-HPV持續(xù)感染[2]，HR-HPV感染后會(huì)影響機(jī)體免疫功能，尤其對(duì)宮頸及陰道局部免疫微環(huán)境造成較大影響。有研究發(fā)現(xiàn)[3]，HR-HPV持續(xù)感染會(huì)導(dǎo)致宮頸局部Th1/Th2免疫平衡向Th2方向漂移，并影響相關(guān)免疫炎癥因子表達(dá)水平。良好的陰道微生態(tài)作為局部防御免疫屏障，可直接反映局部免疫狀態(tài)，并與患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸存在密切關(guān)系。本研究選取收治的HPV感染患者為研究對(duì)象，探討HR-HPV感染患者陰道免疫微環(huán)境改變及其與預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取2019年5月至2020年4月本院婦科門(mén)診收治的HPV感染女性患者125例為研究對(duì)象，根據(jù)HPV分型檢測(cè)結(jié)果將患者分為HR-HPV組與非HR-HPV組。HR-HPV組67例，年齡27～50歲，平均年齡(42.16±4.50)歲；產(chǎn)次0～3次，平均產(chǎn)次(2.15±0.36)次；有分娩史41例，無(wú)分娩史26例；感染HPV16型31例，HPV18型27例，其他9例。非HR-HPV組58例，年齡29～51歲，平均年齡(43.16±5.42)歲；產(chǎn)次0～3次，平均(2.20±0.35)次；有分娩史35例，無(wú)分娩史23例。另選取本院體檢科健康志愿者女性50例為對(duì)照組，年齡25～50歲，平均年齡(43.20±4.62)歲；產(chǎn)次0～3次，平均(2.23±0.33)次；有分娩史30例，無(wú)分娩史20例。3組研究對(duì)象年齡、產(chǎn)次、分娩史等資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具可比性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)陰道鏡下活檢、宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查、HPV-DNA檢測(cè)確診；近2周未使用抗生素、雌孕激素；取樣7 d內(nèi)無(wú)陰道用藥、灌洗史；患者自愿參與本研究。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)：合并血液系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫功能疾病；合并惡性腫瘤、尿路感染；1個(gè)月內(nèi)使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑；妊娠期及哺乳期。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 方法： 囑患者取樣前48 h禁性生活，取樣時(shí)取膀胱截石位，窺陰器以5 mL無(wú)菌生理鹽水灌洗宮頸及陰道側(cè)壁上1/3，停留10 s后吸回收集于無(wú)菌EP管中，3 000 r/min離心3 min后取上清液，-20℃冷藏待測(cè)。取上清液解凍后采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)IFN-γ、IL-4含量，計(jì)算IFN-γ/IL-4值，試劑盒購(gòu)自南京檢測(cè)生物研究所；取剩余上清液采用EPICS XL型流式細(xì)胞儀(美國(guó)C0ULTER公司生產(chǎn))檢測(cè)CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群水平，使用試劑為原廠配套試劑。

1.5 觀察指標(biāo)：收集受檢者免疫炎癥因子(IFN-γ、IL-4)水平、CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群水平，并自患者入院后隨訪2年，記錄患者病情加重比率。

2 結(jié)果

2.1 3組陰道灌洗液免疫炎癥因子水平比較： HR-HPV組陰道灌洗液IFN-γ水平明顯低于非HR-HPV組與對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IL-4、IFN-γ/IL-4均顯著高于非HR-HPV組與對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組陰道灌洗液免疫炎癥因子水平比較

2.2 3組陰道灌洗液CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群水平比較：3組CD8+T細(xì)胞亞群水平組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3組CD4+T細(xì)胞亞群、CD4+/CD8+組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中HR-HPV組CD4+T細(xì)胞亞群水平及CD4+/CD8+顯著低于對(duì)照組與非HR-HPV組(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 3組陰道灌洗液CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群水平比較

2.3 HR-HPV組灌洗液免疫指標(biāo)與預(yù)后的關(guān)系:HR-HPV組患者入院后均接受規(guī)范化治療，出院后隨訪2年，共34例病情加重，病重率為27.20%(34/125)。比較病重組與平穩(wěn)組患者灌洗液免疫指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，平穩(wěn)組IFN-γ水平高于病重組，而IL-4、IFN-γ/IL-4均顯著低于病重組(P<0.05)；平穩(wěn)組CD4+、CD4+/CD8+均明顯高于病重組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同預(yù)后HPV感染患者灌洗液免疫指標(biāo)比較

3 討論

流行病學(xué)研究表明[4]，宮頸癌為全球婦女致死率排名第二的惡性腫瘤，僅次于乳腺癌。目前已證實(shí)HR-HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病與進(jìn)展的高風(fēng)險(xiǎn)因素。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)[5-6]，HPV感染與宮頸局部微環(huán)境免疫功能密切相關(guān)，而宮頸微環(huán)境主要受陰道黏膜免疫系統(tǒng)與陰道局部免疫細(xì)胞及其炎癥因子調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，陰道微生態(tài)由菌群、陰道結(jié)構(gòu)及其免疫功能構(gòu)成，能有效抵御入侵病菌和抑制炎癥反應(yīng)，且其一直處于動(dòng)態(tài)平衡生理狀態(tài)，菌群失調(diào)或免疫功能降低均可致其局部免疫調(diào)節(jié)紊亂，增加HPV感染風(fēng)險(xiǎn)。因此，研究陰道免疫微環(huán)境對(duì)HR-HVP感染患者的病情及預(yù)后評(píng)定具有積極的作用。

有學(xué)者認(rèn)為[9-10]，HVP感染并非嚴(yán)格意義上的疾病，因?yàn)閷?duì)免疫功能正常人群而言HPV感染可通過(guò)宿主免疫反應(yīng)自發(fā)清除，且2年新發(fā)感染轉(zhuǎn)陰率超過(guò)80%。提示HVP感染與患者機(jī)體免疫功能存在密切聯(lián)系，而Th細(xì)胞在抗病毒中發(fā)揮著重要作用，尤其是Th1細(xì)胞。國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)[11-12]，HPV持續(xù)感染會(huì)導(dǎo)致Th1向Th2漂移，使機(jī)體清除病毒的免疫預(yù)防能力降低而誘導(dǎo)宮頸組織癌變。IFN-γ為T(mén)h1細(xì)胞分泌的免疫因子，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌一氧化氮合酶而促進(jìn)一氧化氮的合成，從而激活抗病毒免疫反應(yīng)；同時(shí)還能促進(jìn)Th1細(xì)胞的增殖，抑制Th2細(xì)胞分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫效應(yīng)[13]。IL-4由Th2細(xì)胞分泌，可促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，并抑制Th1細(xì)胞分化，最終導(dǎo)致Th1向Th2漂移。因此，通過(guò)檢測(cè)IL-4、IFN-γ水平變化可直接反映Th1/Th2平衡狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，HR-HPV組陰道灌洗液IFN-γ水平明顯低于非HR-HPV組與對(duì)照組(P<0.05)，IL-4、IFN-γ/IL-4均顯著高于非HR-HPV組與對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致。提示HR-HPV感染患者陰道免疫微環(huán)境存在調(diào)節(jié)失衡。分析其原因，可能為HPV持續(xù)感染影響了陰道局部免疫調(diào)節(jié)功能，引起以IFN-γ為代表的Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答向Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答漂移，導(dǎo)致局部抗病毒和抗腫瘤能力降低，幫助HPV逃避免疫監(jiān)視，進(jìn)而影響宮頸局部免疫功能，最終導(dǎo)致宮頸癌變。

陰道免疫微環(huán)境失衡是機(jī)體免疫功能的直接體現(xiàn)。細(xì)胞免疫是抗病毒和抗腫瘤細(xì)胞的主要免疫形式，T淋巴細(xì)胞亞群作為重要的免疫因子，在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[14]。成熟的T淋巴細(xì)胞分為CD4+、CD8+兩個(gè)亞群，CD4+T細(xì)胞為輔助性T細(xì)胞，可通過(guò)分泌細(xì)胞因子輔助和增強(qiáng)免疫細(xì)胞殺傷病毒和腫瘤細(xì)胞的能力，且具有免疫功能，同時(shí)在白介素活化下可分化為T(mén)h1、Th2細(xì)胞；而CD8+T細(xì)胞為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，具有抑制細(xì)胞、體液免疫的作用，通過(guò)CD4+/CD8+可更準(zhǔn)確地反映T細(xì)胞的免疫功能[15]。本研究結(jié)果顯示，3組CD8+T細(xì)胞亞群水平組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3組CD4+T細(xì)胞亞群、CD4+/CD8+組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中HR-HPV組CD4+T細(xì)胞亞群水平及CD4+/CD8+顯著低于對(duì)照組與非HR-HPV組(P<0.05)。進(jìn)一步證實(shí)HR-HPV感染患者陰道細(xì)胞免疫功能降低，進(jìn)而發(fā)展成為癌前病變甚至宮頸癌。另外，本研究通過(guò)分析不同預(yù)后患者陰道灌洗液免疫指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，平穩(wěn)組IFN-γ高于病重組，而IL-4、IFN-γ/IL-4均顯著低于病重組(P<0.05)；且平穩(wěn)組CD4+、CD4+/CD8+均明顯高于病重組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示HR-HPV感染患者陰道免疫微環(huán)境與其預(yù)后存在密切關(guān)系，通過(guò)提高HR-HPV感染患者機(jī)體免疫力，有助改善患者臨床預(yù)后，并可作為抗HR-HPV藥物研發(fā)的重要機(jī)制。

綜上所述，HR-HPV感染患者陰道局部環(huán)境存在Th1/Th2調(diào)節(jié)失衡與細(xì)胞免疫功能降低，其陰道免疫微環(huán)境與患者預(yù)后存在密切關(guān)系，值得臨床參考。