劉 麗，李雅萍，王 娟，張 新，馬 梅，白 晶，常 紅，李建紅，劉月娥

牙周炎主要是以牙齦的炎癥和牙槽骨破壞為主的慢性感染性疾病，在我國35歲以上人群患病率高達96.80%[1]。牙周炎病因復(fù)雜，目前治療手段包括基礎(chǔ)治療、藥物治療及手術(shù)治療，但效果均不理想。牙周炎治療的最終目的是消除牙周炎癥，恢復(fù)牙周組織已喪失的結(jié)構(gòu)和功能，因此局部藥物治療已成為牙周病基礎(chǔ)治療后的有效手段。牙周局部緩釋制劑置入牙周袋后，其中的緩釋藥物成分會被逐步緩慢的釋放，可直接作用于病變組織，保持局部有效的藥物濃度，使用方便，從而達到治療牙周炎的作用[2]。原位凝膠與傳統(tǒng)的親水凝膠不同，其是以黏稠的溶液狀態(tài)存在，當(dāng)藥物注射后會立即在給藥部位發(fā)生相的轉(zhuǎn)變，形成半固態(tài)凝膠，其制備一般由有效藥物和基質(zhì)組成[3]。中藥在口腔疾病的研究與治療相對較少，其在調(diào)節(jié)免疫力、增強牙周組織的防御修復(fù)和再生能力有良好的效果。中藥三七具有止血、散疲、消腫止痛功效，可保護心肌細(xì)胞、降血脂、抗血栓、增強免疫力、抗炎、抗纖維化、消除氧自由基等[4]。三七總皂苷對多種實驗性模型有良好的抗炎作用，能對抗組胺、5-羥色胺等所致毛細(xì)血管通性增加及炎癥組織前列環(huán)素的釋放，抑制巨噬細(xì)胞受到炎癥刺激和白介素的釋放[5]。本研究將三七有效成分與聚丙烯酸樹脂制備成緩釋凝膠，通過牙周炎經(jīng)典改良建模方法成功建模，并觀察藥物對大鼠牙周炎模型的治療效果，為三七作為治療牙周炎藥物的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：全自動高溫高壓滅菌鍋(HV-50，Hirayama，Japan)、Micro-CT(Y.Cheetah機型，掃描電壓90 kV，電流55 μA，掃描分辨率11 μm，像素尺寸1024×1024，德國)，CT圖像重建(vgstudioMax 3.0版本軟件，德國)。PGE2、TNF-α ELISA試劑盒(武漢博士德)，羥甲基纖維素鈉(CMC)，P.g W83(四川大學(xué))，三七(國大藥房，經(jīng)鑒定為三七)，3%戊巴比妥鈉(上海國藥集團化學(xué)試劑公司)，復(fù)方磺胺甲惡唑片(西安金花制藥廠)，PBS液(Sigma，USA)。羥乙基纖維素HEC(天津愛勒易醫(yī)藥材料有限公司)，甘油(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，聚丙烯酸樹脂(Eudragit RS PO羅姆公司)，三乙酸甘油酯(北京精求化工有限責(zé)任公司)。

1.2 動物：SD大鼠30只，清潔級，雄性，體重(170±10)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。實驗過程及動物處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 原位凝膠的制備：本研究通過藥物濃度與藥效的基礎(chǔ)研究和前期試驗基礎(chǔ)及相關(guān)文獻的參考得出三七緩釋凝膠處方配比，見表1。

表1 三七緩釋凝膠配比

具體配置方法：①取處方量的甘油三乙酸酯(保溫35～45 ℃)，加入處方量的聚丙烯酸樹脂(Eudragit RS)攪拌至溶解；②取處方量的甘油加熱至90～100 ℃，在1 200 r/min攪拌速度下加入處方量的羥乙基纖維素，攪拌至溶解；③溫度降至45～50 ℃，將三七提取物按照比例加入，以1 200 r/min攪拌直至藥物溶解；④將得到的溶液在低速攪拌下(20～60 r/min)混合，45～50 ℃保溫條件下攪拌(50～85 r/min)并均質(zhì)(2 800 r/min)1.5～2 h即得。三七總提凝膠淺褐色具有一定的稠度，成非自由流動的凝膠狀態(tài)，通針性好，離心穩(wěn)定性較好，并采用60 CO輻照滅菌后進行微生物限度檢查，照射劑量6 kGy，照射時間為12 h。

1.3.2 動物建模與干預(yù)

1.3.2.1 建模：將實驗大鼠30只隨機均分成2組，建模組25只，將大鼠用3%戊巴比妥鈉按5 mL/kg體重腹腔注射麻醉后，通過絲線結(jié)扎右上第一磨牙聯(lián)合齦溝底涂注牙周致病菌混合液Pg和Fn 80 μL；陰性對照組5只，在雙側(cè)上頜第一磨牙腭側(cè)牙齦溝底涂注80 μL無菌PBS，每隔2 d重復(fù)1次，誘導(dǎo)實驗性牙周炎4周，實驗組和對照組均飼以軟食。建模4周時，采集每只大鼠唾液，將濾紙條置于大鼠頰黏膜建模區(qū)及齦溝處遇阻力停60 s，剪碎放入EP管加入0.5 mL PBS充分勻漿，每只大鼠斷尾取血1 mL，3 000 r/min離心取上清液，檢測PGE2指標(biāo)量，考察牙周炎的形成情況。

1.3.2.2 藥物干預(yù)：將建模成功的25只大鼠隨機分為6只陽性對照，每只牙周炎癥部位1 mL生理鹽水注射，2 d 1次；另外19只牙周炎癥部位給予三七有效成分緩釋凝膠涂注，2 d 1次共干預(yù)1周。藥物治療后1周后采集30只大鼠模型標(biāo)本如下：①唾液采集同上；②血清采集以心臟穿刺取血法，每只大鼠采集全血約3 mL，室溫下靜置2 h 后，3 000r/min 離心15 min，收集并分裝血清，按試劑盒說明書用ELISA檢測PGE2、TNF-α；③處死實驗大鼠后從腭中縫對上頜骨進行銳性分離牙齦組織和上頜骨，并將其在10%中性甲醛溶液固定。置于Micro-CT系統(tǒng)的檢測試管內(nèi)，540°掃描，掃描分辨率10.44 μm×10.44 μm，最后使用Cobra軟件進行三維重建后，觀察各組大鼠的牙槽骨吸收情況。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的大體觀察：建模4周后，建模組大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙頰腭側(cè)牙齦紅腫，易出血，BI=4，PD為(2±0.2)mm，有松動，皮毛無光澤，進食減少，活動笨拙；對照組大鼠牙齦無紅腫，無牙周袋，無松動，毛澤光亮，飲食飲水正常，活動正常。

2.2 ELISA檢測結(jié)果：2組大鼠建模前后唾液、血液中PGE2的水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；大鼠藥物干預(yù)前后唾液及血液中PGE2、TNF-α的水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2至表3。

表2 2組大鼠建模前后唾液、血液中PGE2檢測結(jié)果比較

表3 2組大鼠藥物干預(yù)前后唾液及血液中PGE2、TNF-α檢測結(jié)果比較

2.3 Micro CT檢測結(jié)果：Micro CT 圖像顯示，正常組牙槽嵴飽滿(圖1A，目錄后)，無明顯附著喪失，小梁致密排列有序；模型組(圖1B,目錄后)，牙周韌帶增寬，硬骨板不連續(xù)，牙槽骨有垂直骨吸收，附著喪失明顯，根分叉暴露；給藥后(圖1C，目錄后)，牙槽骨破壞改善，牙槽嵴高度略有增加，附著喪失減少，根分叉暴露減少。

3 討論

牙周炎本身是一種細(xì)菌感染性疾病，細(xì)菌及細(xì)菌毒素又可激發(fā)宿主的炎性免疫反應(yīng)，PGE2、TNF-α、IL-8、IL-1β等既可促進結(jié)締組織基質(zhì)的降解，也可刺激牙槽骨的吸收，還可通過自分泌和旁分泌途徑，引起炎癥的加重和擴大，是牙周炎過程中產(chǎn)生的主要炎性細(xì)胞因子[6]。骨破壞是由宿主對微生物產(chǎn)生的免疫和炎癥反應(yīng)所介導(dǎo)，然而針對牙周病細(xì)菌的局部免疫反應(yīng)打亂了骨形成和骨吸收的穩(wěn)態(tài)平衡，從而導(dǎo)致骨丟失的機制建立[7]。原位凝膠給藥系統(tǒng)是藥劑學(xué)領(lǐng)域的一個研究熱點，是一種新型的藥物釋放系統(tǒng)[8]，其制備簡單，使用方便，具有組織相容性、生物降解性及生物粘附性，與黏膜組織親和力強，能發(fā)揮良好的釋藥性能。實驗性大鼠牙周炎動物模型的建立為進一步探討和發(fā)現(xiàn)牙周病的病因和疾病的發(fā)生發(fā)展過程提供理論依據(jù)，為臨床治療建立必要的實驗依據(jù)[9]。

本研究將篩選出的三七有效成分制備成中藥牙周原位凝膠，應(yīng)用于實驗大鼠牙周炎模型并觀察療效，從牙周炎的臨床癥狀、分子生物學(xué)、影像學(xué)等方面觀察到了牙周炎的表現(xiàn)，結(jié)果提示通過經(jīng)典的原位凝膠制備方法成功制備了三七牙周原位緩釋凝膠；牙周炎是一種慢性炎癥性疾病，牙周炎癥期間可以產(chǎn)生許多細(xì)胞因子，其中PGE2是參與牙周炎骨破壞作用最經(jīng)典的細(xì)胞因子，它在牙周炎的進展中發(fā)揮重要作用，可作為牙周炎的診斷指標(biāo)之一[10-11]。建模前后 ELISA檢測大鼠模型唾液、血液PGE2含量，經(jīng)統(tǒng)計分析后可見建模組表達顯著高于對照組。通過Micro CT 檢測了建模組較正常對照組在上頜第一磨牙的腭側(cè)和根分叉區(qū)觀察到了明顯的牙槽骨垂直喪失影像，口內(nèi)觀察到了明顯的牙齦炎癥，觸碰易出血，有較深的牙周袋。本次實驗從各個方面進行驗證，均證明此次模型符合牙周炎的要求，說明建模成功。TNF-α可以激活牙周組織的保護性免疫反應(yīng)[12]，大量的TNF-α可加速炎癥反應(yīng)以及激活骨組織的破壞，從而對宿主造成傷害[13]。FAGUNDES[14]等研究證實，TNF-α的出現(xiàn)與Pg密切相關(guān)，較高的炎性介質(zhì)與進展性的臨床破壞程度有關(guān)。本實驗結(jié)果表明，藥物干預(yù)后建模組PGE2、TNF-α水平明顯高于正常組，治療組的PGE2、TNF-α水平明顯低于建模組。牙周炎的癥狀主要包括牙齦炎癥、牙周袋形成、牙槽骨喪失及牙齒的松動甚至脫落[15]。在本次研究中，藥物干預(yù)組較建模組牙槽骨密度增高，且牙齦粉韌，牙周袋變淺，觸碰不易出血。這些結(jié)果與其他相關(guān)研究基本一致。

通過動物實驗的藥效學(xué)觀察結(jié)果說明，三七有效成分制備的牙周原位緩釋凝膠對牙周炎的治療有一定的療效，具體作用機理以及劑量、藥效評價、藥物在人體用藥的藥效學(xué)藥代學(xué)還有待于進一步研究探討。本研究結(jié)果為進一步研制三七有效部位及用復(fù)方緩釋凝膠治療牙周炎有一定的理論和實驗指導(dǎo)價值，有望研發(fā)出治療牙周炎的中藥新型制劑，從而為牙周炎臨床防治提供新的方法。