鮑夏君，孫 甜，高旭政，張振旺**

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/醫(yī)學(xué)部醫(yī)藥研究院)

全球糖尿病患病率大幅上升，2019年糖尿病患者人數(shù)為4.63億，預(yù)計(jì)到2045年將達(dá)到7.002億[1]。流行病學(xué)研究報(bào)道，臨床Ⅱ型糖尿病患者的白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性細(xì)胞因子水平明顯升高[2-6]。糖尿病的治療策略與多種因素有關(guān)，包括飲食、運(yùn)動(dòng)和藥物治療[7]。因此，可以考慮使用傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)來預(yù)防、控制和治療糖尿病[8-9]。藏紅花，又名西紅花、番紅花，數(shù)千年來一直被作為傳統(tǒng)藥物的代表，其主要成分包括正庚醛(N-heptanal)、藏紅花酸(Crocetin)、異鼠李素(Isorhamnetin)、山奈酚(Kaempferol)和槲皮素(Quercetin)。藏紅花具有多種藥理作用，包括抗氧化應(yīng)激[10]、抗炎[10]和抗癌[11]等；研究表明藏紅花可顯著降低血糖水平和改善胰島素抵抗[12-13]，并且藏紅花具有抗炎特性，有研究表明藏紅花可以抑制炎癥因子如TNF-α和IL-1β等的轉(zhuǎn)錄[14]。

這些研究表明藏紅花及其主要成分對(duì)糖尿病和炎癥都發(fā)揮著重要的作用。然而，到目前為止，藏紅花對(duì)糖尿病炎癥的影響還沒有以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)研究和評(píng)估。我們通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析并測(cè)量IL-1β、IL-6和TNF-α等幾種細(xì)胞因子的水平來評(píng)價(jià)藏紅花在Ⅱ型糖尿病中炎癥的影響，以系統(tǒng)地分析藏紅花有效成分在Ⅱ型糖尿病中炎癥的影響并量化這些關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 檢索藏紅花治療糖尿病的生物學(xué)靶點(diǎn)信息

通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/search)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)檢索糖尿病相關(guān)靶基因。TCMSP數(shù)據(jù)庫輸入“藏紅花”(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索其主要成分，并進(jìn)行條件篩選(OB≥30%，DL≥0.18)。通過CTD數(shù)據(jù)(http://ctdbase.org/detail.go?acc=C452899&type=chem)檢索藏紅花中主要成分的靶基因。DisGeNET、GeneCards和CTD數(shù)據(jù)庫糖尿病相關(guān)靶基因取交集獲潛在靶基因。運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)繪制蛋白交互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.2 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖并進(jìn)行拓?fù)浜途垲惙治?/p>

用Cytoscape繪制網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)合分析結(jié)果對(duì)靶基因進(jìn)行篩選(Find Clusters:In Whole Network,Include Loops:No,Degree Cutoff:2,Haircut:Yes,Fluff:No,Node Density Cutoff:0.1,Node Score Cutoff:0.2,K-core:2,Max.Depth:100)。運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)繪制蛋白交互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，并用Cytoscape軟件中的MCODE插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖進(jìn)行聚類分析。

1.3 生物學(xué)靶點(diǎn)富集分析

應(yīng)用DAVID online(https://david.ncifcrf.gov/)功能富集分析和KEGG分析，并用Cytoscape繪制KEGG分析出的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.4 ELISA檢測(cè)炎癥因子

糖尿病并發(fā)癥動(dòng)物模型聯(lián)盟(AMDCC)(http://www.diacomp.org/shared/protocols.aspx)描述了小鼠遵循的糖尿病誘導(dǎo)方案。給予8周大的C57小鼠(蘇州西山生物技術(shù)有限公司)多劑量(每24h，共5劑)鏈脲佐菌素(STZ)(檸檬酸鹽緩沖液中的50mg/kg BW)。實(shí)驗(yàn)分組為：control組(正常小鼠)，control+Cro組(正常小鼠腹腔注射Crocetin)，DM組(糖尿病模型組)和DM+Cro組(糖尿病小鼠腹腔注射Crocetin)，在所有實(shí)驗(yàn)中使用10只動(dòng)物/組。在STZ注射后1周和之后每周測(cè)量一次血糖和尿白蛋白，當(dāng)空腹血糖≥11.1mmol/L，認(rèn)為糖尿病模型成功。造模成功后，Crocetin(檸檬酸鹽緩沖液中的50mg/kg BW)腹腔注射，連續(xù)注射一周后，眼球取小鼠全血樣品后于室溫放置2h，1000×g離心20min，取上清待測(cè)。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μL，分別將樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照100μL/孔加入相應(yīng)孔中，用封板膜(透明)封住反應(yīng)孔，室溫孵育120min。加入生物素化抗體100μL/孔(TNF-α試劑盒，碧云天，貨號(hào)PT512；IL-6試劑盒，碧云天，貨號(hào)PI326；IL-1β試劑盒，碧云天，貨號(hào)PI301)。用封板膜封住反應(yīng)孔，室溫孵育60min。洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin 100μL/孔。用封板膜封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育20min。室溫偏低時(shí)(低于25℃)，需要適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間。洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。加入顯色劑TMB溶液100μL/孔，用封板膜(白色)封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育20 min。室溫偏低時(shí)需要適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間，此時(shí)可以孵育至標(biāo)準(zhǔn)品和樣品出現(xiàn)非常顯著的顏色變化。加入終止液50 μL/孔，混勻后立即測(cè)量A450值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)，通過樣品的吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的相應(yīng)濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)形式均以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，多組數(shù)據(jù)間比較以one-way ANOVA檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)之間采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 藏紅花4種主要成分在糖尿病的潛在靶基因

DisGeNET和GeneCards數(shù)據(jù)庫分別檢索得到1267和12966個(gè)與糖尿病相關(guān)的靶基因。篩選這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的重疊基因，得到1149個(gè)糖尿病相關(guān)靶基因。TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到藏紅花中的70種成分，并進(jìn)行條件篩選(OB≥30%，DL≥0.18)后獲得5種(圖1)，包括N-heptanal(Molecule ID：MOL001389)、Crocetin(PubChem CID:5281232)、Isorhamnetin(PubChem CID:5281654)、kaempferol(PubChem CID:5280863)和Quercetin(PubChem CID:5280343)。CTD數(shù)據(jù)庫中分別檢索得到Crocetin、Isorhamnetin、Kaempferol和Quercetin的14、54、167和4129個(gè)靶基因(未檢索到N-heptanal相關(guān)靶基因)。篩選DisGeNET、GeneCards和CTD數(shù)據(jù)庫的重疊靶基因，獲得藏紅花上述Crocetin、Isorhamnetin、Kaempferol和Quercetin 4種主要成分在糖尿病共有相關(guān)靶基因分別為12、35、75和525個(gè)(圖2A)。藏紅花4種主要成分在糖尿病共有相關(guān)靶基因647(除去重復(fù)基因后剩538)個(gè)，其中Crocetin、Isorhamnetin、Kaempferol和Quercetin 4種主要成分在糖尿病共有靶基因有Rela(是NF-κB的主要組成部分)、TNF-α和IL-6，Isorhamnetin、Kaempferol和Quercetin 3種主要成分在糖尿病共有18個(gè)靶基因，Crocetin、Kaempferol和Quercetin 3種主要成分在糖尿病共有5個(gè)靶基因(圖2B)。分析藏紅花4種主要成分在糖尿病的相關(guān)靶基因的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖3A)，篩選得到171個(gè)潛在靶基因(圖3B)，進(jìn)一步濃縮潛在靶基因，獲得12個(gè)潛在靶基因(圖3C)。

圖2 藏紅花主要成分在糖尿病中的共有靶基因

圖3 藏紅花主要成分在糖尿病作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.2 藏紅花4種主要成分在糖尿病治療的潛在信號(hào)通路

對(duì)藏紅花4種主要成分在糖尿病的171個(gè)潛在靶基因的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖進(jìn)行聚類分析(圖4A、B、C、D)。聚類分析結(jié)果顯示共得到4個(gè)關(guān)聯(lián)非常緊密的集群：Cluster 1∶score=59.014，Nodes=72，Edges=2095(圖4A)；Cluster 2∶score=13.156，Nodes=46，Edges=296(圖4B)；Cluster 3∶score=6.000，Nodes=27，Edges=78(圖4C)；Cluster 4∶score=3.273，Nodes=12，Edges=18(圖4D)。這4個(gè)集群的KEGG分析結(jié)果(圖4E、F、G、H)顯示PI3K-AKT、MAPK、HIF、TNF、FoxO和IL-17等炎癥相關(guān)信號(hào)通路在多個(gè)集群中出現(xiàn)。

圖4 藏紅花4種主要成分在糖尿病的潛在靶基因聚類分析和KEGG分析

2.3 藏紅花4種主要成分集群在糖尿病治療的潛在生物功能

藏紅花4種主要成分在糖尿病538個(gè)靶基因聚類分析顯示關(guān)聯(lián)非常緊密的集群，將集群進(jìn)行GO分析結(jié)果顯示，其在糖尿病中的生物過程主要包括：凋亡過程、對(duì)凋亡的調(diào)節(jié)、防御反應(yīng)、對(duì)含氧化合物的反應(yīng)、活性氧代謝過程、炎癥反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)、基因表達(dá)和蛋白質(zhì)代謝的正向調(diào)控、細(xì)胞活化、蛋白質(zhì)修飾過程的調(diào)控、細(xì)胞能量代謝過程(包括能量?jī)?chǔ)備、葡萄糖代謝和多糖代謝)等(圖5上)。4個(gè)集群在糖尿病中的細(xì)胞成分主要包括：分泌囊(包括分泌顆粒、囊泡腔)、細(xì)胞膜外部封裝結(jié)構(gòu)(膜微域、膜側(cè))、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、染色體(包括染色質(zhì))、血小板α顆粒腔、細(xì)胞器內(nèi)膜(滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、包涵體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的內(nèi)在成分)、細(xì)胞基板連接(膠原蛋白、細(xì)胞間小管)、中等密度脂蛋白顆粒、受體復(fù)合物(脂多糖受體復(fù)合物)等(圖5中)。4個(gè)集群在糖尿病中的分子功能主要包括：受體調(diào)節(jié)器活動(dòng)(信號(hào)受體結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合)、蛋白結(jié)合(酶結(jié)合、含有復(fù)合結(jié)合的蛋白質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、SH3域綁定、載脂蛋白綁定、蛋白脂復(fù)合體結(jié)合、伴侶蛋白綁定和熱休克蛋白結(jié)合等)、細(xì)胞因子活性、生長(zhǎng)因子活性、DNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、化學(xué)引誘物的活動(dòng)、蛋白激酶活性、激素綁定、抗氧化活性、胰島素約束等(圖5下)。

圖5 藏紅花的4種主要成分基因集群在糖尿病中的主要生物功能

2.4 藏紅花4種主要成分對(duì)糖尿病炎癥因子具有抑制作用

已知Crocetin、Isorhamnetin、Kaempferol和Quercetin四種主要成分在糖尿病的共有靶基因Rela(是NF-κB的主要組成部分)、TNF-α和IL-6，所以使用STZ構(gòu)建小鼠糖尿病模型，選取藏紅花主要成分Crocetin處理糖尿病小鼠，ELISA方法檢測(cè)小鼠各組血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，結(jié)果顯示Crocetin具有顯著抑制炎癥因子的作用，IL-1β、TNF-α和IL-6等炎癥因子為藏紅花治療糖尿病的關(guān)鍵靶基因(圖6)。

圖6 藏紅花酸對(duì)糖尿病小鼠炎癥因子的抑制作用

3 討 論

本文研究目的是探索藏紅花主要成分Crocetin、Isorhamnetin、Quercetin和Kaempferol在糖尿病的抗炎作用及其所涉及的潛在分子機(jī)制。糖尿病是一個(gè)重要的醫(yī)學(xué)問題，它可以導(dǎo)致慢性全身炎癥，而這種慢性炎癥還會(huì)導(dǎo)致糖尿病的長(zhǎng)期并發(fā)癥，包括非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、視網(wǎng)膜病變、心血管疾病和腎病等，并且可能導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病與其他疾病(如阿爾茨海默病、多囊卵巢綜合征、痛風(fēng)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)。藏紅花作為一種中草藥，含有藏紅花酸、黃酮類化合物和藏紅花素等多種活性成分，能有效調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，在降低糖尿病的影響方面發(fā)揮主要作用。

我們分析了藏紅花有效成分與Ⅱ型糖尿病疾病之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，如：藏紅花有效成分與糖尿病相關(guān)因子之間的靶向關(guān)系，藏紅花有效成分通過聚集分析獲得4個(gè)關(guān)聯(lián)非常緊密的集群，進(jìn)一步分析獲得4個(gè)集群在糖尿病中的生物過程包括：凋亡過程、活性氧代謝過程、炎癥反應(yīng)等；4個(gè)集群在糖尿病中的細(xì)胞成分主要包括：細(xì)胞器內(nèi)膜(滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、包涵體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的內(nèi)在成分)、中等密度脂蛋白顆粒、受體復(fù)合物(脂多糖受體復(fù)合物)等；4個(gè)集群在糖尿病中的分子功能主要包括：DNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、化學(xué)引誘物的活動(dòng)、蛋白激酶活性、抗氧化活性、胰島素約束等。本研究顯示藏紅花的主要成分Crocetin、Isorhamnetin、Quercetin和Kaempferol可能通過調(diào)節(jié)NF-κB、TNF-α和IL-6等炎癥因子抑制糖尿病炎癥反應(yīng)，且ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)藏紅花酸能顯著抑制糖尿病IL-1β、TNF-α和IL-6等炎癥因子。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，藏紅花有效成分Crocetin、Isorhamnetin、Quercetin和Kaempferol可通過糖尿病的多靶點(diǎn)、多通路聯(lián)合作用初步探索藏紅花治療糖尿病的潛在機(jī)制。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，藏紅花可能通過共有靶基因(NF-κB、TNF-α和IL-6)、炎癥相關(guān)信號(hào)通路(PI3K-AKT、MAPK、HIF、TNF、FoxO和IL-17)、生物過程(凋亡過程、防御反應(yīng)、活性氧代謝過程和蛋白質(zhì)代謝等)、細(xì)胞成分(分泌囊、細(xì)胞器內(nèi)膜、中等密度脂蛋白顆粒和受體復(fù)合物等)、分子功能(信號(hào)受體、蛋白結(jié)合、蛋白結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、DNA轉(zhuǎn)錄因子、化學(xué)引誘物、蛋白激酶、激素綁定、抗氧化、胰島素約束等)等途徑參與糖尿病的治療。最后我們通過ELISA檢測(cè)了糖尿病小鼠血液中炎癥因子水平，結(jié)果表明，藏紅花酸能顯著降低IL-1β、TNF-α和IL-6的水平。IL-1β、TNF-α和IL-6可能是藏紅花治療糖尿病的潛在靶點(diǎn)。這些結(jié)果提示藏紅花的抗糖尿病炎癥作用可能與其對(duì)上述潛在靶點(diǎn)和通路的直接或間接調(diào)控有關(guān)，為藏紅花在DM炎癥治療中的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和研究思路。