張曉雯，徐康彥，王幫華，胡美純**

(1.湖北科技學院醫(yī)學部藥學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院醫(yī)學部基礎(chǔ)醫(yī)學院)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占全部顱內(nèi)腫瘤的40%～50%[1]。根據(jù)腫瘤惡性程度劃分成Ⅰ～Ⅳ等級，其中生長最快、惡性程度最高、最難以治愈的腫瘤亞型為膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma，GBM)，屬于IV級惡性膠質(zhì)瘤，可侵襲腦或脊髓的鄰近細胞，腫瘤為浸潤性且發(fā)展迅速[2]。盡管目前有手術(shù)切除、化療和放療等多種治療方法，晚期膠質(zhì)瘤患者的平均中位生存期仍然不足15個月，僅有3.3%的GBM患者存活超過兩年。隨著GBM發(fā)病的分子機理不斷闡明，許多小分子靶向化療藥物得以研發(fā)并應用于臨床[3]。然而，現(xiàn)有臨床實踐表明影響多數(shù)膠質(zhì)瘤患者化療效果的最主要原因之一就是血腦屏障的阻礙，以及腫瘤細胞的異質(zhì)性和耐藥性，最終導致預后不良[4]。開發(fā)治療膠質(zhì)瘤的新藥具有極大的理論研究意義和臨床應用價值。

蝙蝠葛堿(dauricine，Dau)是從山豆根的根莖中提取分離的雙芐基四氫異喹啉生物堿，具有較高的脂溶性，易透過血腦屏障。蝙蝠葛堿最早用于抗炎和抗心律失常的治療；近年來研究表明其對結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌細胞均具有抑制作用[5]。本研究的目的是用體外實驗分析膠質(zhì)瘤細胞生長和凋亡規(guī)律，確定蝙蝠葛堿對膠質(zhì)瘤細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

人腦星型膠質(zhì)母細胞瘤U87細胞株購自美國模式菌種收集中心ATCC細胞庫。

1.1.2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；二甲基亞砜、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購于美國Gibco公司；青鏈霉素購于吉諾醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、結(jié)晶紫、RIPA裂解液、PMSF、Cocktail、磷酸化蛋白酶抑制劑、ECL發(fā)光試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；脫脂奶粉購于美國BD公司；MTT、Tris堿、Glycine、SDS、牛血清白蛋白、甘油、甲醇、溴酚藍、40%丙烯酰胺、TEMED等試劑購自上海生工生物；NC膜(Millipore)、過硫酸銨(Sigma-Aldrich)、胎牛血清(Gibco)、100×青霉素+鏈霉素混合液P/S(Invitrogen)購自湖北妙威生物醫(yī)藥公司；p53抗體(#9282，Cell Signaling Technology)、Bax抗體(#2774，Cell Signaling Technology)、Bcl-2抗體(YY0032R，Abbkine)、切割型Caspase-3抗體(ab32042，Abcam)、切割型PARP抗體(ab32064，Abcam)、β-Actin抗體(#A5441，Sigma-Aldrich)購自武漢蜂鳥生物科技有限公司；蝙蝠葛堿購于上海源葉生物科技有限公司(HPLC檢測純度98%以上)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將U87接種于含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素+硫酸鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基，放置于5%CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱中。待細胞生長至85%時傳代，收集對數(shù)期細胞進行實驗。

1.2.2 細胞存活率實驗(MTT法)

取對數(shù)期生長的U87細胞，調(diào)整細胞濃度為5×104/mL接種于96孔板內(nèi)，每孔100μL，置于培養(yǎng)箱中孵育至細胞單層鋪滿孔底，加入濃度梯度(0、2.5、5、7.5、10、15、20μmol/L)的蝙蝠葛堿溶液作用48h。每孔加10μL 0.5%MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加150μL二甲基亞砜，室溫搖床低速振蕩10min，使甲瓚結(jié)晶物充分溶解。酶標儀490nm處檢測各孔吸光度值。

1.2.3 細胞克隆形成實驗

取對數(shù)期生長的U87細胞，消化重懸，按每孔2×103接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，分別加入含0、2、4μmol/L蝙蝠葛堿的培養(yǎng)基，培養(yǎng)7～14d，每兩天觀察1次，至集落形成。棄去培養(yǎng)液，PBS洗3遍，用4%的多聚甲醛固定細胞15min，PBS洗3次，0.1%的結(jié)晶紫溶液染色10min，沖洗，晾干。在自然光照下用數(shù)碼照相機拍攝白光明場照片。

1.2.4 細胞凋亡實驗

取對數(shù)期生長的U87細胞，調(diào)整細胞濃度為5×104/mL接種于96孔板內(nèi)，每孔100μL，置于培養(yǎng)箱中孵育至細胞單層鋪滿孔底，分別加入濃度為0、1、10、20μmol/L的蝙蝠葛堿作用48h后顯微鏡明場拍照，檢測蝙蝠葛堿對U87細胞形態(tài)的影響。再取對數(shù)期生長的U87細胞消化重懸，調(diào)整細胞數(shù)為3×105/mL，以每孔200μL的細胞懸液滴加到24孔板中的爬片上，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。棄去培養(yǎng)基，分別加入0、10、15、20μmol/L濃度的蝙蝠葛堿溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。棄去培養(yǎng)基，用PBS潤洗，4%多聚甲醛固定10min后PBS洗滌3遍，避光加入Hoechst 33342染色液(P0133，碧云天)，室溫孵育5min，PBS洗滌3遍。載玻片上滴一滴抗熒光猝滅劑，蓋上貼有細胞面的爬片，OLYMPUS正置熒光顯微鏡下用UV激發(fā)光觀察拍照。

1.2.5 Western blot

將不同濃度(0、5、7.5、10μmol/L)蝙蝠葛堿處理24h的U87細胞用預冷的PBS洗3遍，棄去洗液，每皿加適量裂解工作液(RIPA裂解液、PMSF、Cocktail、磷酸化蛋白酶抑制劑)，在冰上裂解10min，再用細胞刮刀收集，4℃ 12 000rpm離心15min，收集上清。用BCA試劑盒測定蛋白濃度并定量，按1∶5加入Loading buffer，100℃煮7min。制備SDS凝膠，每孔蛋白上樣總量為40μg，進行電泳分離，調(diào)節(jié)恒壓80V至溴酚藍運動到濃縮膠與分離膠分界處，再調(diào)節(jié)電壓為120V，待溴酚藍到底部時終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜前將PVDF膜用甲醇浸泡激活，按照“三明治”法轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫搖床1h封閉，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10min，二抗室溫孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min。在暗室里將ECL發(fā)光液滴在膜上，曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 蝙蝠葛堿抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞的增殖

用MTT法測試不同濃度(0、2.5、5、7.5、10、15、20μmol/L)的蝙蝠葛堿對U87細胞增殖能力的影響程度，結(jié)果如圖1A所示。藥物作用48h后，細胞活力隨著藥物濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢，蝙蝠葛堿對U87細胞的增殖抑制IC50為15.792μmol/L。劑量5μmol/L和7.5μmol/L組與對照組相比均具有顯著差異(P<0.05)，10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L組與對照組相比具有極顯著差異(P<0.01)。當藥物濃度達到20μmol/L時，抑制率接近90%。結(jié)果表明在48h時蝙蝠葛堿對U87細胞生長具有濃度依賴性抑制作用。

2.2 蝙蝠葛堿抑制U87細胞的克隆形成

由圖1B可見，對照組U87細胞在培養(yǎng)10d后形成了大面積的細胞集落，反映出細胞增殖能力強，群體依賴性高。當蝙蝠葛堿濃度達到2μmol/L時，明顯抑制了U87的克隆集落形成，抑制率上升至37.5%，當藥物濃度為4μmol/L時，抑制率達到72.0%，抑制能力顯著增強。與對照組相比，2μmol/L和4μmol/L的蝙蝠葛堿對膠質(zhì)瘤細胞的克隆形成抑制能力都具有極顯著差異(P<0.01)。結(jié)果表明，蝙蝠葛堿能顯著抑制U87細胞的克隆形成。

(與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，n=3)

2.3 蝙蝠葛堿誘導U87細胞凋亡

我們將蝙蝠葛堿處理48h后的U87細胞進行白光明場拍照觀察，可看到對照組U87細胞形態(tài)飽滿、輪廓清晰、細胞核形大、細胞密度均勻并呈堆疊狀排列。1μmol/L蝙蝠葛堿處理的U87細胞尚能維持正常形態(tài)，但當濃度增大到10μmol/L后，出現(xiàn)明顯的細胞密度減小，細胞間隙增大，細胞形態(tài)也發(fā)生不同程度的異形變化，細胞大小不均一；當藥物濃度達到20μmol/L時，大量細胞變圓死亡，上述細胞形態(tài)變化均符合細胞凋亡的形態(tài)特征(圖2A)。我們推斷蝙蝠葛堿具有誘導膠質(zhì)瘤細胞凋亡的作用，為了驗證此猜想，我們在熒光顯微鏡下對U87細胞進行Hoechst 33342染色(圖2B)。實驗結(jié)果顯示，U87對照組的細胞核形態(tài)橢圓、邊緣平整，核染色呈現(xiàn)暗藍色。與對照組相比，10μmol/L蝙蝠葛堿給藥組細胞首先出現(xiàn)活細胞數(shù)目減少，細胞核變大、染色質(zhì)固縮、邊緣模糊。隨著給藥濃度從10μmol/L增大到15μmol/L，U87細胞核形態(tài)更為顯著，表現(xiàn)為核凹陷、褶皺、裂解，呈現(xiàn)核內(nèi)致密深染。當蝙蝠葛堿濃度達到20μmol/L時，細胞大量死亡，細胞核破碎產(chǎn)生凋亡小體，顏色呈現(xiàn)亮白深染，證明隨著蝙蝠葛堿給藥濃度的升高，U87細胞發(fā)生了程度愈加明顯的凋亡現(xiàn)象。

圖2 Dauricine誘導U87細胞發(fā)生凋亡

2.4 蝙蝠葛堿對U87細胞p53、Bax、Bcl-2、Caspase-3和PARP蛋白表達的影響

我們用蝙蝠葛堿處理U87細胞24h，凋亡相關(guān)蛋白的表達水平發(fā)生了變化。Western blot(圖3)顯示促凋亡蛋白Bax的表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達下降。另外我們還檢測到切割型Caspase-3和PARP明顯升高。在凋亡過程中p53起著重要作用：實驗發(fā)現(xiàn)p53在蝙蝠葛堿的作用下表達顯著上調(diào)。

圖3 Dauricine對U87細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

3 討 論

中草藥的植物成分天然小分子單體日益成為治療各種腫瘤的重要化合物來源，中草藥有效成分也已成為輔助膠質(zhì)瘤治療的一大探索方向[6-7]。蝙蝠葛堿就是來源于天然植物山豆根根莖中的生物堿，可透過血腦屏障。我們的實驗探討了蝙蝠葛堿在體外對膠質(zhì)瘤細胞的影響，蝙蝠葛堿不僅顯著抑制了膠質(zhì)瘤細胞的增殖，也誘導U87細胞凋亡。Western blot分析結(jié)果顯示，蝙蝠葛堿顯著降低膠質(zhì)瘤細胞中Bcl-2的表達水平，并增加Bax、p53、切割的PARP及Caspase-3的表達。

p53是重要的轉(zhuǎn)錄因子，也是重要的癌癥治療靶標，調(diào)控著腫瘤的發(fā)生和凋亡[8]。野生型p53活化后可以修復受損的DNA，參與細胞G1期阻滯，誘導細胞凋亡[9]。我們的實驗結(jié)果顯示隨著蝙蝠葛堿藥物濃度的升高，p53的表達也逐漸增強。p53轉(zhuǎn)錄后又可以激活下游的促凋亡蛋白Bax和Bak(“BH123”或“多結(jié)構(gòu)域”蛋白質(zhì))，使線粒體外膜滲透，導致細胞色素c和其他蛋白質(zhì)從膜內(nèi)釋放，啟動線粒體凋亡途徑；同時p53可以直接抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的轉(zhuǎn)錄[10]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)蝙蝠葛堿處理后，Bax表達上升，Bcl-2表達下降。在細胞質(zhì)中，細胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子1相互作用，結(jié)合并激活Caspase-9，進而激活其下游Caspase-3前體蛋白產(chǎn)生切割型Caspase-3。后續(xù)我們將研究更深層次的信號通路并提供更有利的動物體內(nèi)實驗加以論證，為將蝙蝠葛堿開發(fā)成為治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的小分子靶向藥物提供理論依據(jù)和實驗支持。