何 冰，杜麗葉，李志華，謝 洋，劉莉燕#，房娉平

(1.邯鄲市中心醫(yī)院康復(fù)科，河北 邯鄲 056000； 2.邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)五科，河北 邯鄲 056000)

目前癲癇(epilepsia，EP)的治療以西藥治療為主，但仍有約1/3的患者無法利用藥物控制EP，繼而發(fā)展成為難治性EP，嚴重影響患者健康[1-2]。傳統(tǒng)中藥積雪草為傘形科植物積雪草的干燥全草，常用于調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)、治療精神類疾病。積雪草苷(AS)從積雪草中提取而來，具有抗氧化、保護缺氧心肌細胞、抗纖維化等藥理作用，可用于心腦血管疾病的治療，還可以增強癡呆患者的認知能力，但對于能否提高EP患者認知能力及相關(guān)機制鮮有報道[3-4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)在細胞整個過程的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)存在于真核生物中，參與類固醇、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖原等合成，可以維持細胞穩(wěn)態(tài)，而氧化應(yīng)激、鈣離子失衡等多種因素會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)[5]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是一種脫乙酰酶，參與細胞分化、增殖、衰老和凋亡的發(fā)生。Li等[6]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激活SIRT1表達可以減輕ER stress，進而改善糖尿病小鼠的認知功能。但SIRT1/ER stress通路是否參與AS對EP的影響尚不清楚。本研究通過構(gòu)建EP小鼠模型，探索AS對EP小鼠認知功能、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及SIRT1/ER stress通路蛋白的影響，以期為EP的治療尋找新的潛在藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：BALB/c小鼠60只(北京腦科學(xué)與類腦研究中心提供)，雄性、清潔級、6周齡，體重23～28 g，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2020-0005。所有小鼠飼養(yǎng)于22～25 ℃(溫度)、55%～65%(濕度)環(huán)境中，給予小鼠充足的光照、水及飼料。

1.1.2 儀器：Morris水迷宮(型號:ACT-200A)、酶標儀(型號:Fax-20100)和凝膠成像系統(tǒng)(型號:Gelstudio)均購自張家港市青松生物醫(yī)學(xué)儀器有限公司。

1.1.3 藥品與試劑：AS(原料藥，純度≥98.8%，批號為JXC-02)購自桂林紐泰生物科技有限公司；丙戊酸鈉片(批號為20210611，規(guī)格為0.2 g)購自湖南省湘中制藥有限公司；氯化鋰溶液(批號為TW2917)、匹羅卡品(批號為TW2920)、白細胞介素6(IL-6，批號為TW11676)、超氧化物歧化酶(SOD，批號為TW12776)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒和蛋白提取試劑盒(批號為TW19124)均購自上海通蔚實業(yè)有限公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α，批號為SP32174)、丙二醛(MDA，批號為SP38199)ELISA試劑盒均購自武漢賽培生物科技有限公司；SIRT1(批號為ab110304)、轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP，批號為ab192591)、免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BIP，批號為ab21685)、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK，批號為ab229912)、磷酸化PERK(p-PERK，批號為ab169528)、真核翻譯起始因子-2α(eIF2α，批號為ab30271)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α，批號為ab30276)、β-肌動蛋白(β-actin，批號為ab19115)單克隆抗體均購自美國Abcam公司；羊抗鼠二抗(批號為SAB450017)購自上海易匯生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠EP模型的制備：所購小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，參照文獻[7]的造模方法制備EP小鼠模型。經(jīng)小鼠腹腔注射氯化鋰溶液180 mg/kg，30 min后腹腔注射匹羅卡品30 mg/kg，觀察小鼠EP發(fā)作程度。EP持續(xù)狀態(tài)(SE)稱為EP發(fā)作，參照Racine分級標準[8]，當SE不低于Ⅲ級發(fā)作視為造模成功。若小鼠未達到Racine分級Ⅲ級及以上標準，則此后每隔30 min給予匹羅卡品追加劑量10 mg/kg腹腔注射，直至出現(xiàn)Racine分級Ⅲ級及以上標準為止。匹羅卡品的最大注射劑量為60 mg/kg，若達到最大劑量仍未造模成功，則更換新的小鼠重新造模，造模過程小鼠無死亡。成功造模50只小鼠。

1.2.2 分組及給藥：將成功造模的50只小鼠隨機分為模型組，AS低、中及高劑量組，陽性對照組，每組10只。另取10只健康小鼠作為對照組(對照組小鼠僅按“1.2.1”中的方法腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液)。AS低、中及高劑量組小鼠分別給予20、40及80 mg/kg的AS進行灌胃干預(yù)(AS和蒸餾水相溶配制成質(zhì)量濃度分別為2、4及8 mg/mL的溶液，灌胃體積10 mL/kg)[9]；陽性對照組小鼠給予0.2 g/kg的丙戊酸鈉進行灌胃干預(yù)(丙戊酸鈉和蒸餾水相溶配制成質(zhì)量濃度為0.02 g/mL的混懸液，灌胃體積10 mL/kg)[10]；模型組、對照組小鼠灌胃等量蒸餾水；1日1次，干預(yù)2周。

1.2.3 觀察小鼠SE次數(shù)及總持續(xù)時間：觀察并記錄小鼠干預(yù)2周之后的第1日的SE次數(shù)及總持續(xù)時間。

1.2.4 小鼠認知功能檢測：采用Morris水迷宮實驗測定小鼠認知功能[11]。將水池等分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4個象限，將平臺置于第Ⅰ象限中央并低于水面2 cm，每日上下午從Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ象限區(qū)域?qū)⑿∈蠓湃胨?，記錄其尋找并爬上平臺的時間為逃避潛伏期，該值越長表明小鼠的認知功能越差；若小鼠在90 s內(nèi)仍未找到平臺，則引導(dǎo)其找到平臺，并記為90 s，持續(xù)訓(xùn)練4 d，每日訓(xùn)練4次，逃避潛伏期取4次的平均值。第5日撤去平臺，記錄120 s內(nèi)小鼠游過平臺位置的次數(shù)，游過的次數(shù)越少表明小鼠的認知功能越差。

1.2.5 ELISA法檢測小鼠血清中IL-6、TNF-α水平以及腦組織中SOD、MDA水平：待小鼠認知功能檢測結(jié)束后，采用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，取眼部血液，離心用于ELISA法檢測小鼠血清中IL-6、TNF-α水平。斷頭處死小鼠，解剖分離小鼠腦組織，離心取上清液，一部分用于ELISA法檢測小鼠腦組織中SOD、MDA水平；另一部分儲存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)蛋白質(zhì)印跡法檢測。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測小鼠腦組織中SIRT1/ERstress通路蛋白表達：取上述適量腦組織，提取總蛋白、檢測總蛋白濃度，電泳分離目的蛋白，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉。依次加入稀釋的SIRT1(1∶ 500)、CHOP(1∶ 500)、BIP(1∶ 500)、PERK(1∶ 300)、p-PERK(1∶ 300)、eIF2α(1∶ 400)、p-eIF2α(1∶ 400)、β-actin(1∶ 1 000)一抗于4 ℃冰箱中孵育過夜。洗膜后，加入二抗(1∶ 2 500)室溫孵育2 h，顯色、拍照、收集圖像，用Image J軟件分析灰度值，得到目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠SE次數(shù)和總持續(xù)時間比較

與對照組相比，模型組小鼠SE次數(shù)和總持續(xù)時間增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，AS低、中、高劑量組以及陽性對照組小鼠SE次數(shù)和總持續(xù)時間降低(P<0.05)，AS低、中及高劑量組呈劑量依賴性(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；AS高劑量組與陽性對照組小鼠SE次數(shù)和總持續(xù)時間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組小鼠SE次數(shù)和總持續(xù)時間比較

2.2 各組小鼠認知功能比較

與對照組相比，模型組小鼠逃避潛伏期延長，游過平臺位置的次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，AS低、中、高劑量組以及陽性對照組小鼠逃避潛伏期縮短，游過平臺位置的次數(shù)增加(P<0.05)，AS低、中及高劑量組呈劑量依賴性(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；AS高劑量組與陽性對照組小鼠逃避潛伏期和游過平臺位置次數(shù)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組小鼠逃避潛伏期和游過平臺位置次數(shù)比較

2.3 各組小鼠血清IL-6、TNF-α以及腦組織SOD、MDA水平比較

與對照組相比，模型組小鼠血清IL-6、TNF-α以及腦組織MDA水平升高，腦組織SOD水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，AS低、中、高劑量組以及陽性對照組小鼠血清IL-6、TNF-α和腦組織MDA水平降低，腦組織SOD水平升高(P<0.05)，AS低、中及高劑量組呈劑量依賴性(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；AS高劑量組與陽性對照組小鼠血清IL-6、TNF-α以及腦組織MDA、SOD水平的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組小鼠血清IL-6、TNF-α和腦組織SOD、MDA水平比較

2.4 各組小鼠腦組織SIRT1/ER stress通路蛋白表達水平比較

與對照組相比，模型組小鼠腦組織SIRT1蛋白表達水平降低，CHOP、BIP、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，AS低、中、高劑量組以及陽性對照組小鼠腦組織SIRT1蛋白表達水平升高，CHOP、BIP、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α蛋白表達水平降低(P<0.05)，AS低、中及高劑量組呈劑量依賴性(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；AS高劑量組與陽性對照組小鼠腦組織SIRT1、CHOP、BIP、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α蛋白表達水平的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1、表4。

表4 各組小鼠腦組織SIRT1/ER stress通路蛋白表達水平比較

A.對照組；B.模型組；C.AS低劑量組；D.AS中劑量組；E.AS高劑量組；F.陽性對照組

3 討論

EP是一種因大腦神經(jīng)元同步異常放電而引發(fā)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，不僅影響患者的生活質(zhì)量，還會伴隨抑郁、認知缺陷和焦躁等并發(fā)癥的出現(xiàn)[12]。目前，治療EP的藥物易產(chǎn)生精神和運動等方面的不良反應(yīng)，且30%的患者會對EP治療藥物產(chǎn)生耐藥性，故尋求臨床不良反應(yīng)低的潛力藥物和療法非常重要[13]。氯化鋰-匹羅卡品聯(lián)合使用可造成動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮，在短時間內(nèi)產(chǎn)生EP癥狀，引發(fā)呼吸障礙、腦組織缺血缺氧，促使炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激發(fā)生，導(dǎo)致腦神經(jīng)細胞凋亡，損壞認知功能[14]。本研究采用腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品建立EP小鼠模型，當SE不低于Ⅲ級發(fā)作時，表明造模成功，可用于下一步的研究。

積雪草是《中華人民共和國藥典：一部》(2010年)收載的中藥，味苦、辛，性寒，有清熱利濕、解毒消腫的功效，常用于治療皮膚創(chuàng)傷、癰疽、熱證等，具有較廣的藥用價值，AS是積雪草中的活性成分[3]。Zhang等[15]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注損傷模型中，AS降低了細胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激水平，為治療腦損傷提供了新途徑。Guo等[16]的研究結(jié)果證明，AS可以減輕自噬體的形成以及自發(fā)改變行為的損傷，可有效預(yù)防大鼠腦缺血介導(dǎo)的認知障礙和神經(jīng)元損傷。在EP發(fā)病過程中，過度興奮的大腦神經(jīng)元會刺激炎癥細胞釋放大量的炎癥因子，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)進而導(dǎo)致細胞損傷，其中TNF-α作為炎癥趨化因子，可導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進而加劇炎癥損傷；IL-6的釋放將導(dǎo)致大量活性氧產(chǎn)生，進一步加重氧化應(yīng)激損傷。一旦有大量活性氧生成，便會加大SOD需求量，活性氧破壞分子結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生MDA，因此，SOD、MDA含量在一定程度上代表氧化應(yīng)激的反應(yīng)程度[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠SE次數(shù)和總持續(xù)時間、逃避潛伏期，血清IL-6、TNF-α水平，以及腦組織MDA水平高于對照組，游過平臺位置的次數(shù)少于對照組，腦組織SOD水平低于對照組；經(jīng)AS干預(yù)后，小鼠SE次數(shù)和總持續(xù)時間、逃避潛伏期，血清IL-6、TNF-α，以及腦組織MDA水平降低，游過平臺位置的次數(shù)增加，腦組織SOD水平升高。表明AS可以降低炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激程度，改善EP小鼠的癥狀及認知功能，但具體研究機制還有待探索。

SIRT1是廣泛分布于細胞內(nèi)、生物學(xué)功能較廣的一種酶。研究結(jié)果表明，上調(diào)SIRT1的表達對醋酸鉛誘導(dǎo)的小鼠認知障礙，具有保護作用[18]。ER stress是由細胞內(nèi)環(huán)境失衡造成的亞細胞器發(fā)病過程，與EP腦損傷中異常蛋白質(zhì)的加工密切相關(guān)[19]。Zhang等[20]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補腎益智方可以通過增加SIRT1的蛋白質(zhì)表達，降低ER stress相關(guān)蛋白表達，改善小鼠認知功能障礙。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠腦組織SIRT1蛋白表達水平低于對照組，CHOP、BIP、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α蛋白表達水平高于對照組；經(jīng)AS干預(yù)后，小鼠腦組織SIRT1蛋白表達水平升高，CHOP、BIP、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α蛋白表達水平降低。表明AS可以激活EP小鼠SIRT1蛋白表達，緩解腦組織ER stress。

綜上所述，AS可以改善EP小鼠的認知功能，降低小鼠的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激程度，可能與激活SIRT1蛋白表達、緩解ER stress有關(guān)。但由于EP作用機制復(fù)雜，進一步的機制有待研究。