董明駿 李增攀 周挺

膿毒癥是指病原微生物經(jīng)過各種途徑進(jìn)入體內(nèi)而引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，隨著病情的進(jìn)展，膿毒癥可發(fā)展為嚴(yán)重膿毒癥，甚至感染性休克、多器官功能障礙綜合征，最后導(dǎo)致多器官功能衰竭，是急診和重癥監(jiān)護(hù)病房患者的主要死亡原因之一[1]。全球每年新增上百萬例膿毒癥患者，其中約1/4的膿毒癥患者死亡[2]。雖然新型抗菌藥物研究、免疫治療技術(shù)、器官功能支持治療技術(shù)不斷增強(qiáng)，但膿毒癥并沒有得到有效控制[3]。目前關(guān)于膿毒癥的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，臨床治療也缺乏特異、有效的治療手段，主要依靠各種輔助治療策略。因此深入研究膿毒癥發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點及早期診斷生物標(biāo)志物具有重要的臨床意義。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和普及，生物信息學(xué)技術(shù)受到普遍關(guān)注，目前廣泛運用于各種疾病的分子機(jī)制研究。本研究利用基因綜合表達(dá)（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫的膿毒癥患者芯片，篩選出膿毒癥的差異基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從而發(fā)現(xiàn)與膿毒癥相關(guān)的關(guān)鍵基因和信號通路，以期為更好地診斷與治療膿毒癥提供新思路。

1 資料和方法

1.1 資料來源 以“Sepsis”作為搜索詞，進(jìn)入美國國立生物中心的GEO數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中搜索已公布的基因芯片數(shù)據(jù)集，獲取數(shù)據(jù)集GSE28750、GSE57065、GSE95233芯片。本研究從GSE28750芯片選取10例膿毒癥患者外周血樣本為膿毒癥組，20名健康志愿者外周血樣本為對照組；從GSE57065芯片選取28例膿毒癥患者確診后30 min外周血樣本為膿毒癥組，25名健康志愿者外周血樣本為對照組；從GSE95233芯片選取51例膿毒癥患者入院時外周血樣本為膿毒癥組，25名健康志愿者外周血樣本為對照組。

1.2 差異基因的篩選 使用在線分析工具GEO2R（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r）分別對3個基因集的膿毒癥組與對照組之間差異基因進(jìn)行分析，以校正P＜0.01、｜logFC｜≥1.5作為篩選差異基因的閾值，其中l(wèi)ogFC≥1.5作為表達(dá)上調(diào)基因，log FC≤-1.5作為表達(dá)下調(diào)基因。利用在線工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）對數(shù)據(jù)集表達(dá)上、下調(diào)基因取交集，并繪制韋恩圖。

1.3 差異基因的功能和通路富集分析 使用DAVID在線網(wǎng)站（https://david.ncifcrf.gov/home/jsp）對篩選到的差異基因進(jìn)行基因本體論（gene ontolo gy，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。GO分析包括生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能。

1.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks，PPI）的構(gòu)建和關(guān)鍵基因的篩選 利用數(shù)據(jù)庫STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）對篩選出的差異基因進(jìn)行PPI構(gòu)建。使用MCODE和cytohubba插件共同篩選出PPI的關(guān)鍵基因，并篩選出最顯著模塊進(jìn)行差異基因的功能和通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 差異基因的篩選 從GSE28750芯片篩選出差異基因512個，包括213個表達(dá)上調(diào)基因和299個表達(dá)下調(diào)基因；從GSE57065芯片篩選出差異基因520個，包括256個表達(dá)上調(diào)基因和264個表達(dá)下調(diào)基因；從GSE95233芯片篩選出差異基因612個，包括231個表達(dá)上調(diào)基因和381個表達(dá)下調(diào)基因。對3個芯片篩選出的差異基因取交集得到差異基因275個，包括112個表達(dá)上調(diào)基因和163個表達(dá)下調(diào)基因，見圖1。

圖1 GSE57065、GSE95233和GSE28750芯片表達(dá)上、下調(diào)基因的韋恩圖（a：表達(dá)上調(diào)基因；b：表達(dá)下調(diào)基因）

2.2 差異基因的GO和KEGG分析GO分析顯示，差異基因主要參與免疫反應(yīng)、T細(xì)胞受體信號通路、固有免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程，細(xì)胞組分主要集中在質(zhì)膜細(xì)胞表面、胞外外體、質(zhì)膜外側(cè)等，分子功能主要集中在MHCⅡ類蛋白復(fù)合物結(jié)合、磷脂轉(zhuǎn)運ATP酶活性、MHCⅡ類受體活性、CD4受體結(jié)合等。KEGG分析顯示，差異基因主要富集于T細(xì)胞受體信號通路、造血細(xì)胞系、病毒性心肌炎、炎癥性腸病、Ⅰ型人類嗜T細(xì)胞病毒感染等通路。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵基因的篩選Cytoscape軟件可視化分析所得PPI網(wǎng)絡(luò)包括265個節(jié)點和910條邊，見圖2a（插頁）；利用MCODE插件篩選出最顯著的模塊，共包含25個基因，見圖2b（插頁）。對最顯著模塊中的基因進(jìn)行GO分析顯示，差異基因主要參與T細(xì)胞受體信號通路、T細(xì)胞活化、T細(xì)胞共刺激、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、細(xì)胞表面受體信號通路等生物學(xué)過程，細(xì)胞組分主要集中在T細(xì)胞受體復(fù)合物、質(zhì)膜外側(cè)、質(zhì)膜、免疫突觸、α-βT細(xì)胞受體復(fù)合物等，分子功能主要集中在T細(xì)胞受體結(jié)合、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶活性、蛋白激酶結(jié)合、跨膜信號受體活性等。對最顯著模塊中的基因進(jìn)行KEGG分析顯示，差異基因主要富集于T細(xì)胞受體信號通路、原發(fā)性免疫缺陷、造血細(xì)胞系、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、細(xì)胞黏附分子等通路。利用cytoHubba插件篩選出PPI連接度前10的關(guān)鍵基因，分別為白細(xì)胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）4、CD8A、C-C趨化因子配體5（chemokine C-C motif ligand 5，CCL5）、淋巴細(xì)胞特異蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，LCK）、CD28、CD2、白介素7受體（interleukin 7 receptor，IL-7R）、CD3E、白介素2受體β亞基（interleukin 2 receptor beta，IL-2Rβ）、穿孔素（perforin，PRF）1，均包含在最顯著的模塊中，見圖2c（插頁）。

圖2 PPI的構(gòu)建和關(guān)鍵基因的篩選（a：PPI；b：PPI核心模塊；c：連接度前10的關(guān)鍵基因）

3 討論

盡管近年來關(guān)于膿毒癥的研究越來越多，但膿毒癥死亡率仍居高不下，這可能是由于缺乏早期診斷膿毒癥的有效生物標(biāo)志物。隨著基因芯片技術(shù)的迅速發(fā)展，人類開始從基因?qū)用嫣剿骷膊〉姆肿訖C(jī)制。本研究利用GEO2R分析GSE57065、GSE95233和GSE28750芯片中膿毒癥患者的共同差異基因，共得到231個表達(dá)上調(diào)基因和381個表達(dá)下調(diào)基因。通過GO分析進(jìn)一步了解差異基因的潛在生物學(xué)功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要參與T細(xì)胞受體信號通路、免疫相關(guān)、細(xì)胞質(zhì)膜組成等生物學(xué)過程；KEGG分析顯示，差異基因主要集中在T細(xì)胞受體信號通路、造血細(xì)胞系、病毒性心肌炎、炎癥性腸病、Ⅰ型人類嗜T細(xì)胞病毒感染等相關(guān)通路。目前認(rèn)為膿毒癥是由于過度全身性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂所致，而且中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)調(diào)控[4]。研究表明，微生物感染可以刺激造血干細(xì)胞分化成髓樣細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)[2，5]。這些差異基因主要參與炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答相關(guān)機(jī)制，與膿毒癥分子機(jī)制一致。進(jìn)一步用STRING數(shù)據(jù)庫對差異基因進(jìn)行PPI構(gòu)建，利用MCODE篩選出最顯著的模塊，共包含25個基因。對這些基因進(jìn)行KEGG分析，結(jié)果顯示主要參與T細(xì)胞相關(guān)信號通路、跨膜受體信號通路、細(xì)胞膜組成、原發(fā)性免疫缺陷、造血細(xì)胞系、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、細(xì)胞黏附分子等通路；與差異基因KEGG分析結(jié)果大體一致，更說明T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、造血細(xì)胞系在膿毒癥的發(fā)病機(jī)制中的重要作用。利用CytoHubba分析篩選出10個關(guān)鍵基因，包含CD4、CD8A、CD28、CD2、CD3E、以 及CCL5、LCK、IL-7R、IL-2Rβ、PRF1，且均來自核心模塊。

免疫反應(yīng)失衡是膿毒癥主要機(jī)制之一，膿毒癥的免疫功能紊亂與T淋巴細(xì)胞密切相關(guān)[6]。CD4、CD8A、CD28、CD2、CD3E作為T細(xì)胞表面活性分子，在免疫應(yīng)答過程中起著重要作用；其中CD4、CD8 T淋巴細(xì)胞在膿毒癥中的作用已被廣泛認(rèn)知。Harland等[7]發(fā)現(xiàn)CD8A的CpG甲基化在CD8的下調(diào)中具有潛在作用。然而，這種表觀遺傳修飾是否參與膿毒癥的過程尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。CD2可與淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原CD58和CD48/BCM1相互作用，介導(dǎo)T細(xì)胞與其他細(xì)胞類型之間的黏附，參與T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在炎癥反應(yīng)中也起著重要作用[8-9]。CD28是T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)的共刺激分子，在抗原遞呈細(xì)胞上與B7結(jié)合，介導(dǎo)T細(xì)胞的共刺激并促進(jìn)其存活、增殖以及向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移，目前在膿毒癥中已有廣泛研究。研究表明，膿毒癥患者T細(xì)胞上的CD28表達(dá)下調(diào)[10-11]。一項研究表明，CD28對膿毒癥期間的腸道免疫反應(yīng)具有保護(hù)作用[12]。另有研究表明，阻止CD28信號傳導(dǎo)可減弱炎癥細(xì)胞因子反應(yīng)和細(xì)菌負(fù)荷，提高壞死性軟組織感染小鼠模型的存活率[13]。CD3E作為CD3蛋白一個亞鏈，在T細(xì)胞發(fā)育中起著重要作用，參與T細(xì)胞內(nèi)部的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，CD3E基因缺陷會導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫缺陷[14]，但目前在膿毒癥中的研究尚未見報道。CCL5主要由血小板、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞產(chǎn)生，通過與相應(yīng)的受體結(jié)合發(fā)揮作用，它在病原體清除、抗原呈遞、白細(xì)胞活化和存活、慢性炎癥、組織修復(fù)、纖維化、胚胎發(fā)生和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15-16]。Hwaiz等[17]發(fā)現(xiàn)，Rac1通過調(diào)節(jié)血小板CCL5的分泌并刺激肺泡中CXCL2產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)膿毒血癥肺損傷中性粒細(xì)胞的聚集；而抑制CCL5可保護(hù)膿毒癥動物免受肺水腫和組織損傷，因此認(rèn)為CCL5與膿毒癥肺損傷密切相關(guān)，但目前尚無臨床研究證實。LCK是一種非受體酪氨酸蛋白酶，在促進(jìn)T細(xì)胞的成熟、分化及其成熟后的功能方面具有重要作用。當(dāng)T細(xì)胞受到刺激，T細(xì)胞受體激活酪氨酸激酶ZAP70，并且ZAP70再被LCK磷酸化及激活，最終導(dǎo)致淋巴因子的產(chǎn)生[18]。研究表明，LCK的磷酸化通過TLR4信號通路來抑制炎癥風(fēng)暴，LCK可能在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[19]，但是目前關(guān)于LCK在膿毒癥中作用的相關(guān)文章較少，而膿毒癥中細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞耗竭是一個值得研究的治療靶點。IL-7作為趨化因子家族中的重要成員，通過與受體IL-7R結(jié)合來促進(jìn)淋巴細(xì)胞生長、巨噬細(xì)胞活化以及細(xì)胞因子和炎癥因子分泌，從而介導(dǎo)免疫應(yīng)答過程[20]。相關(guān)研究報道IL-7R與自身免疫性疾病、慢性炎癥及腫瘤有關(guān)[21-24]，且在膿毒癥治療和研究中發(fā)揮重要作用。動物實驗表明，IL-7/IL-7R信號通路激活可以提高膿毒癥小鼠存活率[25]。亦有臨床研究認(rèn)為IL-7/IL-7R信號通路與膿毒癥患者淋巴細(xì)胞功能的改善有關(guān)[26]。IL-2Rβ是IL-2R的一個亞單位，通過IL-2結(jié)合觸發(fā)IL-2R，導(dǎo)致大量免疫細(xì)胞的增殖和分化，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，因此與體液免疫關(guān)系密切。目前有研究表明IL-2Rβ與肺癌[27]、特異性皮炎[28]、脂肪肝[29]等疾病密切相關(guān)。此外，IL-2Rβ被認(rèn)為可作為序貫器官衰竭的評價指標(biāo)，且與膿毒癥死亡率呈負(fù)相關(guān)[30]。PRF1為穿孔素蛋白，由自然殺傷細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞及T細(xì)胞分泌，在免疫調(diào)節(jié)和免疫監(jiān)測方面具有重要作用，在腫瘤和免疫性疾病中研究廣泛[31]，但在膿毒癥中鮮有報道。有研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中PRF1基因表達(dá)降低，但其具體作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步明確[32]。

綜上所述，CD4、CD8A、CCL5、LCK、CD28、CD2、IL-7R、CD3E、IL-2Rβ、PRF1是膿毒癥關(guān)鍵基因，可能與膿毒癥發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。后續(xù)將對篩選出的關(guān)鍵基因進(jìn)行基礎(chǔ)實驗的驗證，最終為膿毒癥患者的早期診斷和治療提供有臨床意義的分子靶標(biāo)。