李惠彬，趙清平，余夢虹，錢 瑩*，王 剛

(1.四川省崇州市婦幼保健院婦科，四川 崇州 611230；2.四川省婦幼保健院婦科，四川 成都 610000)

宮頸癌(cervical cancer，CC)是婦科常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率高居女性惡性腫瘤第3位，僅次于乳腺癌及結(jié)直腸癌，已成為嚴(yán)重威脅女性健康的全球性問題[1]。近年我國CC的發(fā)生率逐漸增高，且呈現(xiàn)年輕化趨勢，加強(qiáng)防治非常重要[2]。研究顯示，CC的發(fā)生需要經(jīng)過漫長的宮頸癌前病變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)階段，因此CIN階段的檢查和治療是預(yù)防CC發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3-4]。有證據(jù)表明，血管內(nèi)皮生長因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)是促腫瘤血管產(chǎn)生的主要因子，其表達(dá)增加可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖作用，在多種惡性腫瘤組織中呈高水平表達(dá)[5]。嗅覺介導(dǎo)素4(olfactomedin，OLFM4)是一種糖蛋白，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和發(fā)展轉(zhuǎn)移，在CIN早期診斷方面具有良好應(yīng)用價(jià)值[6]，但在CC中的研究較少。此外，微小RNA-124(microRNA-124，miR-124)是與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的小分子核糖核酸，有報(bào)道指出miR-124具有抑制CC細(xì)胞增殖及遷移的能力[7]?；诖?，本研究嘗試探討VEGF、OLFM4、miR-124檢測在CC、CIN中的表達(dá)情況及臨床意義，旨在為臨床防治CC提供參考。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2015年10月—2018年10月于我院行手術(shù)治療的CC患者82例為CC組，同期CIN患者82例為CIN組，正常宮頸組織標(biāo)本82例為正常組。CC組年齡31～72歲，平均(52.16±9.91)歲；體重指數(shù)19.2～27.3，平均23.21±2.00；絕經(jīng)情況為絕經(jīng)45例，未絕經(jīng)37例；合并癥為高血壓15例，糖尿病12例，高脂血癥8例。CIN組年齡28～73歲，平均(50.83±11.08)歲；體重指數(shù)19.0～27.1，平均23.14±1.97；絕經(jīng)情況為絕經(jīng)42例，未絕經(jīng)40例；合并癥為高血壓12例，糖尿病17例，高脂血癥11例。正常組年齡26～70歲，平均(49.91±10.04)歲；體重指數(shù)18.8～26.7，平均22.87±1.91；絕經(jīng)情況為絕經(jīng)38例，未絕經(jīng)44例；合并癥為高血壓17例，糖尿病10例，高脂血癥6例。3組年齡、體重指數(shù)、絕經(jīng)情況、合并癥比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。所有患者及其家屬均知情同意且簽署知情同意書。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①CC標(biāo)本、CIN標(biāo)本、正常宮頸組織標(biāo)本均經(jīng)病理診斷確診；標(biāo)本均來自于子宮切除后宮頸標(biāo)本；②患者宮頸完整，既往無宮頸手術(shù)或物理治療史；③患者臨床資料完整，能滿足本研究需求。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤者；②CC復(fù)發(fā)患者；③嚴(yán)重感染、臟器功能不全者；④合并其他惡性腫瘤者。

1.3方法 各組組織標(biāo)本取得后即刻置于10%甲醛溶液中固定過夜，取組織標(biāo)本，常規(guī)進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，制片(4 μm)，采用羅氏公司生產(chǎn)的CINtec PLUS型全自動(dòng)免疫組化分析儀，以免疫組織化學(xué)法測定各標(biāo)本中VEGF、OLFM4陽性表達(dá)率，染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，采用BX51光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)下觀察，每個(gè)切片隨機(jī)選取5～10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞，著色細(xì)胞<10%或無著色細(xì)胞為陰性(-)，著色細(xì)胞百分比≥10%為陽性(+)。取組織標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測miR-124水平，采用Trizol法提取總RNA，試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，采用美國Promega公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒(武漢科昊佳生物科技有限公司)說明書設(shè)計(jì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，進(jìn)行熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，miR-124正向引物為5′-GCTAAGGCACGCGGTG-3′，反向引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。內(nèi)參基因?yàn)閁6，U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。應(yīng)用公式2-△△ct計(jì)算miR-124相對表達(dá)水平。

1.4觀察指標(biāo) ①3組組織標(biāo)本中VEGF、OLFM4、miR-124表達(dá)情況。②CC組不同病理參數(shù)(年齡、體重指數(shù)、臨床分期、分化程度、腫瘤直徑)患者組織標(biāo)本中VEGF、OLFM4、miR-124表達(dá)陽性率，分析組織標(biāo)本中各指標(biāo)表達(dá)與CC組病理參數(shù)的關(guān)系。③CC組通過門診或電話隨訪3年，統(tǒng)計(jì)3年內(nèi)復(fù)發(fā)情況，比較3年復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者組織標(biāo)本中VEGF、OLFM4、miR-124表達(dá)情況。④分析VEGF、OLFM4、miR-124聯(lián)合檢測對復(fù)發(fā)預(yù)測價(jià)值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)；采用Spearman相關(guān)系數(shù)模型分析相關(guān)性，采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析預(yù)測價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.13組組織標(biāo)本中VEGF、OLFM4、miR-124表達(dá) VEGF、OLFM4在CC組組織標(biāo)本中陽性表達(dá)率均較CIN組和正常組高，miR-124在CC組組織標(biāo)本中表達(dá)水平均較CIN組、正常組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組組織標(biāo)本中VEGF、OLFM4、miR-124表達(dá)比較

2.2CC組不同病理參數(shù)患者組織標(biāo)本中VEGF、OLFM4、miR-124表達(dá)陽性率 CC組miR-124表達(dá)情況以、miR-124均值為界限，>均值判定為陽性，<均值判定為陰性。不同年齡、體重指數(shù)CC患者組織標(biāo)本中VEGF、OLFM4、miR-124表達(dá)陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且不同腫瘤直徑CC患者組織標(biāo)本中OLFM4、miR-124表達(dá)陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；有臨床分期Ⅱ期、低分化患者組織標(biāo)本中VEGF、OLFM4表達(dá)陽性率均高于臨床分期Ⅰ期、高中分化患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且腫瘤直徑>4 cm患者組織標(biāo)本中VEGF表達(dá)陽性率高于腫瘤直徑≤4 cm患者，有臨床分期Ⅱ期、低分化患者組織標(biāo)本中miR-124表達(dá)陽性率均低于臨床分期Ⅰ期、高中分化患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 CC組不同病理參數(shù)患者組織標(biāo)本中VEGF、OLFM4、miR-124表達(dá)陽性率比較

2.3組織標(biāo)本中各指標(biāo)表達(dá)與CC組病理參數(shù)的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析可知，CC組VEGF、OLFM4、miR-124表達(dá)陽性率與年齡、體重之間無明顯相關(guān)性，且腫瘤直徑與OLFM4、miR-124表達(dá)陽性率無明顯相關(guān)性(P>0.05)；CC組VEGF、OLFM4表達(dá)陽性率與分化程度呈負(fù)相關(guān)，與臨床分期呈正相關(guān)，且組織標(biāo)本中VEGF表達(dá)陽性率與腫瘤直徑呈正相關(guān)(P<0.05)，組織標(biāo)本中miR-124表達(dá)陽性率與分化程度呈正相關(guān)，與臨床分期呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 組織標(biāo)本中各指標(biāo)表達(dá)與CC組病理參數(shù)的關(guān)系

2.4不同預(yù)后CC患者組織標(biāo)本中各指標(biāo)表達(dá)陽性率 3年復(fù)發(fā)患者組織標(biāo)本中VEGF、OLFM4表達(dá)陽性率高于未復(fù)發(fā)患者，miR-124表達(dá)陽性率低于未復(fù)發(fā)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同預(yù)后CC患者組織標(biāo)本中各指標(biāo)表達(dá)陽性率

2.5復(fù)發(fā)預(yù)測價(jià)值分析 VEGF、OLFM4、miR-124對復(fù)發(fā)的預(yù)測AUC分別為0.820、0.895、0.852，聯(lián)合預(yù)測AUC為0.945，明顯高于單一預(yù)測AUC。見圖1。

圖1 復(fù)發(fā)預(yù)測價(jià)值ROC曲線

3 討 論

CC是目前唯一病因明確的婦科惡性腫瘤，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是引發(fā)CC的主要原因，其中90%以上為高危型HPV感染所致[8]。CC患者生物機(jī)制、病理類型等與其預(yù)后聯(lián)系密切，因此加強(qiáng)與CC發(fā)生發(fā)展相關(guān)機(jī)制的研究，有助于疾病早期診治。

VEGF是促進(jìn)人體新生血管形成、增加血管通透性的重要糖蛋白，作為目前已知在腫瘤血管生成中作用最強(qiáng)的中介因子，其可經(jīng)旁分泌作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷徙，從而加速新血管生成，增加腫瘤細(xì)胞周圍血運(yùn)，為腫瘤轉(zhuǎn)移提供有利基礎(chǔ)[9-10]。國內(nèi)蘇文芳[11]研究顯示，CC組織標(biāo)本中VEGF陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織。Fu等[12]報(bào)道指出CC組織中VEGF的表達(dá)明顯上調(diào)。本研究顯示，CC組織標(biāo)本中VEGF陽性表達(dá)率明顯高于正常宮頸組織標(biāo)本，與上述報(bào)道結(jié)果一致，且本研究進(jìn)一步分析了CC與CIN組織標(biāo)本中VEGF的表達(dá)差異，結(jié)果顯示CC組織標(biāo)本中VEGF陽性表達(dá)率明顯升高，而CIN標(biāo)本與正常宮頸組織標(biāo)本中VEGF陽性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明VEGF的表達(dá)升高可促進(jìn)CC的發(fā)生，其作用可能是在CC早期體現(xiàn)，而在CIN階段體現(xiàn)不明顯，據(jù)此推測VEGF檢測可用于CC早期診斷中。本研究還顯示CC組織標(biāo)本中OLFM4陽性表達(dá)率明顯高于CIN及正常宮頸組織標(biāo)本，且CIN組織標(biāo)本中高于正常宮頸組織標(biāo)本，說明OLFM4在CIN階段即可能已經(jīng)參與CC的發(fā)生發(fā)展。OLFM4屬糖蛋白，具有抗細(xì)胞凋亡作用，OLFM4高水平表達(dá)可作用于S期、G2/M期DNA合成，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促使腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)能通過調(diào)節(jié)PI3K/PKB信號通路促腫瘤細(xì)胞生長，還能與細(xì)胞外黏附分子相互作用，參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[13]。但既往有報(bào)道指出OLFM4在CIN2組織中的陽性表達(dá)率為94.0%，與在CC組織中的96.8%接近[14]，與本研究結(jié)果存在一定差異，這可能與CIN組織標(biāo)本的選取不同有關(guān)，仍需通過大樣本研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

此外，近年miRNA在惡性腫瘤發(fā)生進(jìn)展中越來越受臨床重視，miR-124屬于miRNA的一種，有證據(jù)顯示其在CC組織中的表達(dá)降低，能加速癌癥病變，且與癌細(xì)胞過度增殖、凋亡不足、侵襲性生長密切相關(guān)[15]。本研究顯示，CC組織標(biāo)本中miR-124表達(dá)水平均低于CIN及正常宮頸組織標(biāo)本，說明miR-124在CC組織中的表達(dá)明顯降低，與上述報(bào)道結(jié)果一致。miR-124被證實(shí)是一種抑癌基因，具有抑制癌細(xì)胞增殖、遷移的功能[16]，其表達(dá)降低導(dǎo)致對CC細(xì)胞增殖及遷移的抑制作用減弱，最終引起CC。有報(bào)道認(rèn)為miR-124抑癌作用可能與調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化活性有關(guān)，且能調(diào)節(jié)TRAF6等參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17-18]。在以上研究結(jié)果基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步分析了CC患者組織標(biāo)本中VEGF、OLFM4及miR-124表達(dá)情況與患者病理參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果顯示VEGF、OLFM4表達(dá)升高、miR-124表達(dá)降低與CC患者癌細(xì)胞增殖密切相關(guān)，且對預(yù)后復(fù)發(fā)具有一定的預(yù)測價(jià)值，且聯(lián)合價(jià)值更高。

綜上可知，CC患者癌組織中VEGF、OLFM4及miR-124表達(dá)情況與CC生物學(xué)行為密切相關(guān)，聯(lián)合檢測可有效預(yù)測腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)。但本研究仍存在一定不足，如未探究CC患者癌組織中VEGF、OLFM4、miR-124表達(dá)之間的關(guān)系，未能明確三者在CC發(fā)生發(fā)展中是否存在協(xié)同關(guān)系，未來工作中仍需深入探討。