吳八路，梁雨星，周芙玲

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院血液內(nèi)科，湖北 武漢 430000)

急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)是成人最常見的惡性髓性疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計，2020年全球新發(fā)白血病約占新發(fā)腫瘤的2.5%，而死亡比例約為3.1%[2]。目前，AML患者總體生存率不足20%[3]。獲得性染色體異常是AML最重要的獨(dú)立預(yù)測因素[1,4]。然而，對于細(xì)胞遺傳學(xué)正常的AML患者目前尚沒有較好的風(fēng)險預(yù)測因子[5]。因此，尋找新的生物標(biāo)志物具有重要的臨床意義。VNN1(Vanin-1)是一種糖基磷脂酰肌醇錨定表面分子[6]。它在多種疾病中發(fā)揮了重要作用[7]。而VNN1在AML中研究較少。本研究主要分析VNN1在AML中的表達(dá)和其對預(yù)后的影響，探索其臨床價值，為進(jìn)一步研究VNN1在AML中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 資 料 與 方 法

1.1RNA測序數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)分析 通過癌癥基因圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)、組織特異性基因表達(dá)庫(the genotype-tissue expression，GTEx)和高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)集(gene expression omnibus，GEO)檢索并下載急性髓系白血病和正常對照者骨髓細(xì)胞的原始轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(level 3，HTSeq-FPKM)和患者的臨床信息。利用R 3.6.3軟件工具提取VNN1基因的mRNA表達(dá)量，采用Wilcoxon秩和檢驗分析兩組之間基因表達(dá)水平的差異。取AML患者骨髓細(xì)胞和(或)外周血單個核細(xì)胞中VNN1表達(dá)值的中位數(shù)，將AML患者劃分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析VNN1基因表達(dá)水平與患者臨床特征之間的關(guān)系。

1.2VNN1基因表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系的分析 下載TCGA數(shù)據(jù)庫中AML患者的生存隨訪數(shù)據(jù)，結(jié)合VNN1基因的表達(dá)水平，使用乘積限法(Kaplan-Meier，K-M)分析高表達(dá)組與低表達(dá)組患者總體生存率。采用二分類Logistics模型分析自變量VNN1表達(dá)對AML患者臨床特征的影響。采用單因素和多因素Cox回歸分析研究VNN1基因在AML中的預(yù)后價值。

1.3蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction networks，PPI) 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和功能富集分析String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)是一個用于搜索已知蛋白質(zhì)和預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用的開放數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫可應(yīng)用于2 031個物種，是目前覆蓋物種最多，相互作用信息最大的一個數(shù)據(jù)庫。本研究利用STRING 11.5在線數(shù)據(jù)庫分析VNN1 PPI網(wǎng)絡(luò)，探索其可能的分子機(jī)制。搜索時基因名稱欄輸入“VNN1”，物種類型選擇“homo sapiens”，置信度選擇中度置信“0.400”，截點(diǎn)值選擇“不超過10個節(jié)點(diǎn)”。利用STRING 11.5在線分析工具對相互作用基因進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能及京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)的富集分析。

1.4免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性 分析通過單樣本基因集富集分析 (single sample gene set enrichment analysis,ssGSEA) 來評估VNN1與免疫細(xì)胞浸潤之間的相關(guān)性。共獲得了24種浸潤相關(guān)性免疫細(xì)胞。采用Spearman相關(guān)性分析方法分析了VNN1表達(dá)水平與24種免疫細(xì)胞富集評分之間的相關(guān)性。采用Wilcoxon秩和檢驗分析高、低VNN1表達(dá)組的富集分?jǐn)?shù)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，Logistics回歸分析臨床病理特征與VNN1之間的關(guān)系。使用Kaplan-Meier模型評估TCGA中AML患者的預(yù)后因素。使用Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行單變量和多變量分析以估計VNN1表達(dá)對臨床特征與總體生存期的影響。兩組間生存率比較采用Lon-Rank檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1VNN1基因在常見腫瘤中的表達(dá) 通過TCGA數(shù)據(jù)庫,結(jié)合GTEx數(shù)據(jù)庫，顯示VNN1基因在不同類型腫瘤表達(dá)不一，如腎上腺皮質(zhì)癌、乳腺癌、膽管癌、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、肝細(xì)胞癌等腫瘤中都是低表達(dá)的，而在膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、急性髓系白血病、卵巢癌、胃癌等腫瘤中則是高表達(dá)的，且在AML中顯著高表達(dá)(3.306±1.991)(圖1A、B)。多個不同的GEO數(shù)據(jù)集顯示，VNN1在FMS樣酪氨酸激酶3內(nèi)部串聯(lián)突變(FMS-like tyrosine kinease 3-internal tandem duplication，F(xiàn)LT3-ITD)的AML患者中表達(dá)水平顯著高于未發(fā)生突變者(圖1C～E)。

圖1 VNN1在AML和正常對照組中的表達(dá)水平

2.2VNN1基因表達(dá)與AML臨床特征的關(guān)系 根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫中VNN1表達(dá)的中位數(shù)，將AML患者分為高(n=76)和低(n=75)表達(dá)組。評估了VNN1的表達(dá)水平與AML患者臨床病理特征之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示VNN1的表達(dá)與細(xì)胞遺傳學(xué)(P=0.002)、FLT3突變(P=0.041)、核蛋白(nucleophosmin，NPM1)突變(P=0.008)、外周血白細(xì)胞計數(shù)(P=0.022)和總體生存期(overall survival，OS)(P=0.023)相關(guān)，見表1。采用二分類Logistic回歸分析法進(jìn)一步分析VNN1基因表達(dá)與AML臨床特征的關(guān)系。以VNN1表達(dá)水平為因變量(低表達(dá)=0，高表達(dá)=1)；以性別(女性=0，男性=1)，年齡(≤60歲=0，>60歲=1)，白細(xì)胞計數(shù)(<20×109/L=0，≥20×109/L=1)，外周血原始細(xì)胞比例(<70%=0，≥70%=1)，細(xì)胞遺傳學(xué)風(fēng)險(低分險=0，中+高風(fēng)險=1)，F(xiàn)LT3突變狀態(tài)(野生型=0，突變型=1)，大鼠肉瘤蛋白(rat sarcoma，RAS)突變狀態(tài)(野生型=0，突變型=1)，NPM1突變狀態(tài)(野生型=0，突變型=1)，VNN1表達(dá)(低表達(dá)=0，高表達(dá)=1)為自變量。結(jié)果顯示，VNN1與細(xì)胞遺傳學(xué)(P=0.001)、FLT3突變(P=0.042)、NPM1突變(P=0.005)顯著相關(guān)，見表2。

表1 VNN1在AML中的表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系

表2 Logistic回歸分析VNN1表達(dá)與AML患者臨床特征的相關(guān)性

2.3VNN1基因的表達(dá)水平在AML患者中的診斷及預(yù)后價值 通過受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)評估VNN1表達(dá)水平在鑒別AML和正常對照組準(zhǔn)確性方面的價值。結(jié)果顯示VNN1的預(yù)測能力有較高準(zhǔn)確性(曲線下面積=0.969，置信區(qū)間=0.949～0.990)(圖2A)。為了進(jìn)一步了解VNN1表達(dá)水平是否影響AML患者的總體生存期，我們采用了Kaplan-Meier法對TCGA中AML患者的隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行了生存分析。結(jié)果顯示VNN1的表達(dá)水平對AML患者的總生存期有顯著影響，高表達(dá)組患者的中位生存時間為10.1個月，而低表達(dá)組患者的中位生存時間為27.4個月，二者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖2B)；多因素COX回歸分析，以預(yù)后結(jié)局為因變量(生存=0，死亡=1)；以性別(女性=0，男性=1)，年齡(≤60歲=0，>60歲=1)，白細(xì)胞計數(shù)(<20×109/L=0，≥20×109/L=1)，骨髓原始細(xì)胞比例(<20%=0，≥20%=1)，外周血原始細(xì)胞比例(<70%=0，≥70%=1)，法美英分型(French-American-British，F(xiàn)AB)(M0+M1+M2=0，M4+M5=1)，細(xì)胞遺傳學(xué)風(fēng)險(低分險=0，中+高風(fēng)險=1)，F(xiàn)LT3狀態(tài)(野生型=0，突變型=1)，RAS狀態(tài)(野生型=0，突變型=1)，NPM1狀態(tài)(野生型=0，突變型=1)，VNN1表達(dá)(低表達(dá)=0，高表達(dá)=1)為自變量。采用COX模型回歸分析，結(jié)果顯示高表達(dá)的VNN1是除了年齡、細(xì)胞遺傳學(xué)之外又一個重要的獨(dú)立預(yù)測因子。見表3。

圖2 VNN1的表達(dá)水平在AML患者診斷和預(yù)后方面的價值

表3 多因素COX回歸分析 TCGA 中OS 和臨床特征的關(guān)聯(lián)

2.4與VNN1互作的蛋白網(wǎng)絡(luò) 通過STRING數(shù)據(jù)庫分析了與VNN1相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)設(shè)定條件共得到互作蛋白富集的節(jié)點(diǎn)數(shù)11個，其中在PPI網(wǎng)絡(luò)中與VNN1相互作用的蛋白有泛酸激酶1(pantothenate Kinase 1，PANK1)、泛酸激酶3(pantothenate Kinase 3，PANK3)、泛酸激酶2(pantothenate kinase 2，PANK2)、血管非炎性因子2(vascular non-inflammatory molecule 2，VNN2)、血管非炎癥分子3(vascular non-inflammatory molecule 3，VNN3)、膠質(zhì)連接素2(glia-derived nexin 2,SERPIN2)、微量胺相關(guān)受體2(trace amine-associated receptor 2，TAAR2)、微量胺相關(guān)受體5(trace amine-associated receptor 5，TAAR5)、微量胺相關(guān)受體1(trace amine-associated receptor 1，TAAR1)、突觸融合蛋白7(syntaxin-7，STX7)(圖3)。GO功能及KEGG途徑的富集分析顯示其主要參與的生物學(xué)過程有囊泡運(yùn)輸中的核心蛋白復(fù)合體相互作用、泛酸和輔酶A生物合成、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)過程、血小板活化等(圖4)。

圖3 VNN1蛋白-蛋白互作分析

2.5免疫細(xì)胞浸潤分析免疫細(xì)胞浸潤分析顯示VNN1在AML中的表達(dá)水平與中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞(activated dendritic cells,aDC)等富集評分顯著正相關(guān)，而與自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)、T細(xì)胞顯著負(fù)相關(guān)(圖5)。

圖5 VNN1的表達(dá)與AML微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)

3 討 論

氧化應(yīng)激是由于機(jī)體產(chǎn)生氧自由基的酶活性增加，去除氧自由基的酶活性降低，以及抗氧化劑水平不足造成的[8]。脂質(zhì)是對氧化最敏感的分子，細(xì)胞膜脂質(zhì)的氧化導(dǎo)致細(xì)胞膜彈性喪失，細(xì)胞脆性增加，細(xì)胞壽命縮短[9]。持續(xù)的氧化應(yīng)激會誘發(fā)慢性炎癥和許多慢性疾病，包括癌癥[10]。一般而言，腫瘤的發(fā)生包括三個關(guān)鍵階段：第一，以細(xì)胞DNA損傷和基因突變?yōu)闃?biāo)志的啟動階段；第二，以免疫監(jiān)視效率降低和惡性細(xì)胞凋亡率下降為標(biāo)志的促進(jìn)階段；第三，以突變加劇和免疫監(jiān)視失效為標(biāo)志的加劇階段[11]。腫瘤發(fā)生的不同階段幾乎都有活性氧的參與。研究表明，氧化應(yīng)激在AML的發(fā)生發(fā)展過程中同樣發(fā)揮了重要作用[12]。VNN(vanins)是一類能將泛酰巰基乙胺水解為泛酸(也稱維生素B5)和半胱胺的酶[6]。在人體中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三種VNN，其中兩種已證明具有酶活性(VNN1和 VNN2)。而VNN3的作用尚不清楚。目前研究認(rèn)為VNN1的主要功能是參與泛酸循環(huán)，這是合成輔酶A(coenzyme A，CoA)的必要因素[13]。越來越多的研究表明，VNN1在急慢性炎癥、代謝、氧化應(yīng)激、腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都發(fā)揮了重要的作用。例如，在急性和慢性炎癥損傷模型中，敲除VNN1可減少微環(huán)境中的炎癥并提高對全身氧化應(yīng)激的抵抗力[14]。Lu等[15]研究發(fā)現(xiàn)血漿VNN1可以作為一種早期預(yù)測創(chuàng)傷患者發(fā)生敗血癥的重要因子。國外一項研究表明，高血壓患者尿液中VNN1的水平可以提早預(yù)測患者發(fā)生高血壓腎損害的風(fēng)險[16]。機(jī)制研究方面，VNN1能夠水解泛酸并產(chǎn)生維生素B5和半胱胺，半胱胺直接抑制谷胱甘肽合成途徑中的關(guān)鍵酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，而谷胱甘肽是一種重要的抗氧化劑能夠減少機(jī)體氧化應(yīng)激[17]。另一方面，VNN1過表達(dá)也能直接誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平升高，這些因素可能協(xié)同導(dǎo)致組織氧化損傷[18]。Giessner等[19]發(fā)現(xiàn)，VNN1的致癌特性可能是由于在泛酸(維生素B5)和輔酶A的合成途徑中產(chǎn)生了半胱胺，半胱胺直接抑制谷胱甘肽合成中的限速酶-谷氨酰半胱氨酸合成酶，而還原型谷胱甘肽的降低或缺乏會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)的氧化應(yīng)激失去控制，并導(dǎo)致細(xì)胞中活性氧的增加，這可能會破壞DNA并激活致癌基因。目前，已有部分VNN1抑制劑被發(fā)現(xiàn)并已經(jīng)開展臨床應(yīng)用研究[20]。

在這項研究中，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)VNN1在大多數(shù)人類癌癥存在差異表達(dá)，在不同的腫瘤中表達(dá)差異呈現(xiàn)不一致性。VNN1在AML中表達(dá)水平顯著高于正常對照組，VNN1表達(dá)水平在診斷AML和正常對照組方面有著較高的價值。在多個不同的GEO數(shù)據(jù)集均顯示FLT3突變的AML患者VNN1表達(dá)水平顯著高于非突變組；ROC曲線結(jié)果顯示VNN1高表達(dá)預(yù)示AML患者有著較短的生存期，是AML患者潛在的分子預(yù)后標(biāo)志物。單因素和多因素COX回歸分析均顯示高表達(dá)的VNN1對于AML患者而言，是除了年齡、細(xì)胞遺傳學(xué)之外的又一個重要獨(dú)立預(yù)測因子。GO功能及KEGG信號通路的富集分析主要參與的生物學(xué)過程有囊泡運(yùn)輸中的核心蛋白復(fù)合體相互作用、泛酸和輔酶A生物合成、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)過程、血小板活化等。腫瘤免疫細(xì)胞浸潤分析結(jié)果表明，VNN1的表達(dá)水平中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞等富集評分顯著正相關(guān)，而與NK細(xì)胞、T細(xì)胞顯著負(fù)相關(guān)。研究表明，腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞主要包括巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(tumor-associatedneutrophils,TAN)等，它們介導(dǎo)了免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，協(xié)助腫瘤細(xì)胞實現(xiàn)免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤的惡性發(fā)展[21-22]。這些結(jié)果提示，VNN1可能在AML腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞的募集和調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述,本研究主要通過對在線數(shù)據(jù)庫(TCGA、GTEx、GEO)中AML患者的VNN1基因信息進(jìn)行深入挖掘和系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)VNN1基因在AML患者中高表達(dá),且與AML患者不良預(yù)后存在密切關(guān)系，提示它可能在AML的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了促癌作用。此外，我們通過VNN1相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，VNN1相關(guān)基因的主要生物學(xué)功能富集和參與的生物學(xué)過程以及腫瘤免疫細(xì)胞浸潤等進(jìn)行了預(yù)測和分析?？傊瑢τ贏ML患者而言，VNN1可能是一種新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物，并可能為AML治療策略的選擇提供潛在價值。本研究也存在一定的局限性：研究結(jié)果均由生物信息學(xué)分析在線數(shù)據(jù)獲取，尚需進(jìn)一步的實驗驗證。