班月梅，劉小杜，彭益淳，姜佩佩，黃增瓊

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021）

羅漢松實為羅漢松科羅漢松屬植物羅漢松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don和短葉羅漢松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don var.makiEndl.的種子及花托，藥用部位主要為種子［1］?；ㄍ胁糠职被帷⒌V物質(zhì)元素及多糖含量豐富，可食用或泡酒飲用［2-3］。羅漢松實（特指羅漢松種子）味甘，性微溫，具有行氣止痛和養(yǎng)血功效，對胃脘疼痛及血虛面色萎黃等癥狀有明顯療效［1］?！侗静菥V目拾遺》曰：“味甘補腎，其香益肺；治心胃痛，大補元氣?！保?］羅漢松實含有降二萜內(nèi)酯類及萜類化合物、生物堿化合物和黃酮類化合物［5-6］，其提取物具有調(diào)脂、改善心肌供血、保肝、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用［7-8］。民間有應(yīng)用羅漢松實治療心胃痛和胃脘疼痛的歷史。心胃痛為因心前區(qū)疼痛而引起胃脘疼痛，可能與心肌缺血有關(guān)。研究表明，總黃酮具有良好的抗心肌缺血作用［9-10］。本研究中選擇總黃酮作為羅漢松實藥材的含量控制指標成分。羅漢松實藥材資源豐富，但卻鮮有關(guān)于藥材質(zhì)量控制方法的研究報道。為了更好地開發(fā)利用羅漢松實藥材資源，控制藥材質(zhì)量，本研究中對7個不同產(chǎn)地羅漢松實藥材的外觀性狀、顯微鑒別、薄層色譜（TLC）鑒別及水分、總灰分、浸出物、總黃酮的含量進行了研究，建立了羅漢松實藥材質(zhì)量標準?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HR-04A型多功能粉碎機（上海哈瑞斯電器有限公司）；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；箱式電阻爐（上海必爾得儀器實業(yè)有限公司）；SHA-CA型數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（金壇市易晨儀器制造有限公司）；HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；Digital型生物顯微鏡（麥克迪奧光學(xué)儀器有限公司）；ATY224型電子分析天平（日本島津公司，精度為萬分之一）；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥

羅漢松實采集于7個產(chǎn)地（表1），經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室李瓊講師鑒定為羅漢松科植物短葉羅漢松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don var.makiEndl.的種子；羅漢松實總黃酮提取物（實驗室自制）；蘆丁標準品（北京索萊寶科技有限公司，批號為1009H021，純度≥98%）；硝酸鋁（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；亞硝酸鈉（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；氫氧化鈉、無水乙醇均為分析純，購于成都市科隆化學(xué)品有限公司。

表1 羅漢松實藥材來源Tab.1 Sources of Semen Podocarpi

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

取不同產(chǎn)地羅漢松實藥材，用游標卡尺測量，結(jié)果見圖1和表2。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地羅漢松實均呈橢圓形、類圓形或斜卵圓形；種子表面粗糙，常為灰綠色或棕褐色，有突起的不規(guī)則網(wǎng)紋，具白霜附著；質(zhì)堅實，不易破碎；氣微，味淡。

表2 不同產(chǎn)地羅漢松實縱長和直徑測量結(jié)果（±s，cm，n=100）Tab.2 Results of longitudinal length and diameter measuring of Semen Podocarpi from different producing areas（±s，cm，n=100）

表2 不同產(chǎn)地羅漢松實縱長和直徑測量結(jié)果（±s，cm，n=100）Tab.2 Results of longitudinal length and diameter measuring of Semen Podocarpi from different producing areas（±s，cm，n=100）

編號1 2 3 4 5 6 7產(chǎn)地廣西北海市湖北恩施市湖南長沙市四川成都市江西奉新縣江蘇宿遷沭陽縣福建泉州永春縣縱長0.85±0.07 0.81±0.07 0.85±0.08 0.84±0.07 0.84±0.09 0.85±0.06 0.85±0.08直徑0.64±0.06 0.60±0.06 0.64±0.07 0.65±0.06 0.64±0.07 0.65±0.05 0.63±0.06

圖1 廣西產(chǎn)羅漢松種子光學(xué)照片F(xiàn)ig.1 Optical photos of the seeds of Podocarpus macrophyllus from Guangxi Province

2.2 顯微鑒別

切面特征：羅漢松實用單面刀片分別沿縱軸和橫軸切開，置體視顯微鏡下觀察。種子斷面呈米白色，富粉性，為種子胚乳，斷面種皮厚，子葉1，黃棕色；橫切面中心有一小孔，系子葉生長孔道（圖2 A）?？v切面中間有一凹槽，系子葉痕跡，部分可見子葉（圖2 B）。

A.橫切面B.縱切面圖2羅漢松種子橫切面和縱切面顯微照片A.Cross section B.Longitudinal sectionFig.2 Micrographs of cross section and longitudinal section of seeds of Podocarpus macrophyllus

粉末特征：取羅漢松實粉末，過5號篩，按2020年版《中國藥典（四部）》通則2001項下方法［11］230制片，用光學(xué)顯微鏡觀察粉末特征，另在以上處理方法基礎(chǔ)上滴加碘液再制片觀察。肉眼觀察，羅漢松實粉末為黃棕色。顯微鏡下觀察，種皮表皮細胞為黃棕色或灰褐色，呈多邊形或長方形緊密排列；石細胞單個散在或多個成群，淡綠色，呈卵圓形、長方形或不規(guī)則形，壁厚，孔溝明顯；淀粉粒眾多，卵圓形或類圓形，臍點及層紋不明顯，滴加碘液后呈藍色淀粉粒及黃色糊粉粒，兩者多呈糊化狀態(tài)；網(wǎng)紋螺紋導(dǎo)管少見。顯微特征見圖3。

A.種皮表皮細胞B.石細胞C.淀粉粒D.滴加碘液的淀粉粒E.導(dǎo)管F.滴加碘液的糊粉粒圖3羅漢松實粉末顯微特征（×40）A.Epidermal cells of seed coat B.Stone cells C.Starch grain D.Starch grain in iodine solution E.Vessels F.Aleurone grain in iodine solutionFig.3 Microscopic characteristics of Semen Podocarpi powder（×40）

2.3 TLC鑒別

分別取不同產(chǎn)地的羅漢松實粉末8.0 g，過20目篩，置錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲（功率為100 W，頻率為40 kHz）2 h，濾過，濾液蒸干，取少量浸膏加1 mL甲醇溶解制成供試品溶液。以廣西產(chǎn)羅漢松實為對照藥材，同法制備成對照藥材溶液。照2020年版《中國藥典（四部）》通則0502試驗［11］59，吸取上述溶液各10μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（2∶1∶0.5，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點，且斑點顯色清晰，分離度較好。色譜圖見圖4。

2.4 水分、灰分、浸出物測定

水分、總灰分、浸出物測定分別依據(jù)2020年版《中國藥典（四部）》通則0832第四法［11］111、通則2302［11］232、通 則2201［11］234。結(jié) 果 顯 示，7個 產(chǎn) 地 樣 品 的 水 分8.80%～15.13%，多低于13.00%；總灰分為3.47%～4.68%；冷水溶性浸出物為1.41%～3.15%，熱水溶性浸出物為7.13%～9.21%，冷醇溶性浸出物為0.20%～1.39%，熱醇溶性浸出物為0.95～3.89%。詳見表3。

表3 水分、灰分、浸出物測定結(jié)果（%，n=3）Tab.3 Results of content determination of moisture，ash and extract（%，n=3）

1.對照藥材溶液2-7.供試品溶液（編號為2-7）圖4薄層色譜圖1.Reference solution of medicinal materials 2-7.Test solution（number：2-7）Fig.4 TLC chromatograms

2.5 總黃酮含量［12］測定

2.5.1 溶液制備

取羅漢松種子粗粉20 g，置圓底燒瓶中，加6倍量70%乙醇，回流提取1 h，濾過，收集濾液，濾渣重復(fù)提取1次，合并2次濾液，減壓濃縮，80℃烘干。取羅漢松實總黃酮提取物50 mg，精密稱定，置燒杯中，加40 mL 70%乙醇，超聲30 min，溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加70%乙醇定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的供試品溶液，置4℃冰箱保存，備用。取蘆丁標準品20 mg，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液，置4℃冰箱保存，備用。取70%乙醇，置25 mL容量瓶中，搖勻，即得空白對照溶液。

2.5.2 顯色方法

取亞硝酸鈉固體5 g，精密稱定，置燒杯中，加少量純化水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加純化水定容，搖勻，制成5%NaNO2溶液，置4℃冰箱保存，備用。同法制備10%Al（NO3）3溶液和4%NaOH溶液。分別取對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液各適量，置25 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%NaOH溶液5 mL，搖勻，放置15 min，顯色。

2.5.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液0.04，0.08，0.14，0.18，0.22 mL，分別置25 mL容量瓶中，加70%乙醇配制成系列質(zhì)量濃度分別為0.32，0.64，1.12，1.44，1.76 μg/mL的溶液，按2.5.2項下方法顯色，設(shè)置測定波長為253 nm，以空白對照溶液調(diào)零。以對照品溶液質(zhì)量濃度（C，μg/mL）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程A=2.282 3C+0.395 7（r=0.995 2，n=5）。結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在0.32～1.76 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取線性關(guān)系考察項下質(zhì)量濃度為1.12μg/mL的對照品溶液，按2.5.2項下方法顯色，于253 nm波長處，以空白對照溶液調(diào)零，重復(fù)測定6次。結(jié)果的RSD為0.30%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取6份烘干后的總黃酮提取物各50 mg，精密稱定，依法制備供試品溶液。精密量取0.1 mL，置25 mL容量瓶中，按2.5.2項下方法顯色，于253 nm波長處測定吸光度，以空白對照溶液調(diào)零，代入回歸方程計算總黃酮含量。結(jié)果總黃酮平均含量為293.45 mg/g，RSD為4.69%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：精密量取2.5.1項下質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的供試品溶液0.1 mL，置25 mL容量瓶中，按2.5.2項下方法顯色，于253 nm波長處分別于避光放置15，30，45 min時測定吸光度，以空白對照溶液調(diào)零。結(jié)果的RSD為1.73%（n=3），表明供試品溶液在45 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的羅漢松總黃酮提取物6份，各25 mg，精密稱定，分別加入蘆丁標準品3.76 mg，依法制備供試品溶液，分別精密量取0.1 mL，按2.5.2項下方法顯色，于253 nm波長處測定吸光度，以空白對照溶液調(diào)零，計算加樣回收率。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.4 Results of the recovery test（n=6）

2.5.4 樣品含量測定

取7個產(chǎn)地同批次羅漢松實（編號為1-7）總黃酮提取物各50 mg，精密稱定，各3份，依法制備供試品溶液，分別精密量取0.1 mL，按2.5.2項下方法顯色，于253 nm波長處測定供試品溶液吸光度，以空白對照溶液調(diào)零，代入回歸方程計算含量。結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果（mg/g）Tab.5 Results of content determination of total flavonoids in samples（mg/g）

3 討論

3.1 性狀與顯微鑒別

羅漢松實由種子和花托組成，吳魯東等［13］曾對其枝葉進行外觀性狀、薄層鑒別等生藥學(xué)研究，本研究中對羅漢松實進行生藥學(xué)研究。通過對7個產(chǎn)地不同種源羅漢松種子的性狀觀察，可見其性狀基本一致；7個產(chǎn)地的樣品粉末均觀察到大量淀粉粒、糊粉粒和石細胞，可作為羅漢松種子粉末顯微鑒別的標志性特征。羅漢松實含揮發(fā)油［14］，但本研究中的顯微鑒別未發(fā)現(xiàn)7個產(chǎn)地的樣品粉末存在油室或油滴，還需作進一步研究。

3.2 水分、灰分、浸出物測定

由表3可知，大部分樣品水分含量在10%～13%范圍，擬訂羅漢松實藥材含水量為不超過13.0%。中藥材在儲存過程中出現(xiàn)的蟲害、霉變、潮解等變質(zhì)現(xiàn)象多與含水量有關(guān)［15］，要加強對水分的研究和管理，藥材也應(yīng)保存在干燥處?？偦曳衷?.0%～5.0%范圍內(nèi)，擬訂總灰分不超過5.0%。

在進行浸出物測定時，對浸出方法（冷浸法、熱浸法）和溶劑種類（水、乙醇）進行考察，以水、乙醇為溶劑時，所得成分存在差異［16-17］。參考文獻［18-19］，醇溶浸出物中降二萜內(nèi)酯類、黃酮類化合物和揮發(fā)油含量豐富。此外，由于產(chǎn)地、采收季節(jié)和樹齡的差異，不同產(chǎn)地羅漢松種子的浸出物含量也存在一定差異。結(jié)合2020年版《中國藥典（一部）》，同時以7個產(chǎn)地測試結(jié)果最低量擬訂標準，擬訂冷、熱水溶性浸出物分別不低于1.4%和7.0%，冷、熱醇溶性浸出物分別不低于0.2%和0.9%。

3.3 總黃酮含量測定

植物總黃酮因具有廣泛的藥理作用，常作為藥材的質(zhì)量控制指標。前期研究發(fā)現(xiàn)，羅漢松種子中黃酮含量較豐富，且極有可能是羅漢松實藥材治療心胃痛的主要成分［19］。故選擇羅漢松種子總黃酮作為藥材定量控制指標。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地羅漢松種子總黃酮含量差異較大。江西產(chǎn)羅漢松種子總黃酮含量達964.17 mg/g，而四川產(chǎn)僅175.99 mg/g。初步推測，不同產(chǎn)地總黃酮含量的差異與采集地的氣候、日照平均度、地理等外部條件有關(guān)?？紤]到總黃酮含量太低可能對其藥效有影響，故擬將羅漢松種子總黃酮含量限量定為不低于300 mg/g。劉欣宇等［12］測得廣西產(chǎn)羅漢松種子黃酮含量為323.50 mg/g，大于300 mg/g，其差異可能與種子采收時間及批號不同等因素有關(guān)。趙凱麗等［20］曾對廣西羅漢松種子揮發(fā)油化學(xué)組成進行氣相色譜-質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油中含大量川芎嗪，川芎嗪可能是羅漢松實治心胃痛的有效成分。但彭益淳等［14］通過測定不同產(chǎn)地羅漢松種子揮發(fā)油，均未鑒定川芎嗪。潘翠柳等［16］采用對廣西產(chǎn)羅漢松莖、葉、果實部位進行掃描鑒別，不同藥用部位在相同位置均有吸收，方法專屬性不強，不建議使用紫外-可見光譜法作為指標的定性鑒別，可考慮采用紫外指紋圖譜法代替紫外-可見光譜法定性鑒別藥材的質(zhì)量控制指標。此外，本研究中未對不同產(chǎn)地羅漢松實進行紫外指紋圖譜分析，后續(xù)研究重點將進行羅漢松種子化學(xué)成分研究，明確治心胃痛的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，進一步完善質(zhì)量標準。

綜上所述，所建立的方法操作簡便、專屬性好、可行性強，可有效控制羅漢松實藥材的質(zhì)量。