邢倩倩，劉振民，游春蘋,

（1.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436；2.江南大學(xué) 食品營養(yǎng)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122）

乳制品作為代表性的動物源食品，能夠提供人體必需的脂肪、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等。隨著經(jīng)濟發(fā)展和人民生活水平的提高，人類對乳制品的需求量急劇增加，乳制品安全問題，尤其是獸藥殘留問題已成為人們關(guān)注的焦點[1-2]。獸藥殘留是指動物在應(yīng)用獸藥（包括獸藥添加劑）后，蓄積或貯存在細胞、組織或器官內(nèi)，或進入泌乳動物的乳或產(chǎn)蛋家禽蛋中的藥物以及有毒理學(xué)意義的代謝物和藥物雜質(zhì)[3-5]。隨著科技和經(jīng)濟的發(fā)展，畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)逐漸轉(zhuǎn)向現(xiàn)代集約化和規(guī)?；?，為了提高經(jīng)濟效益，類固醇激素可能作為促生長劑被違法添加，用于畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)增加動物體質(zhì)量、提高飼料轉(zhuǎn)化率等[6-7]。

類固醇激素又稱甾體激素，是一種親脂性的小分子物質(zhì)，主要由內(nèi)分泌腺和分散在其他器官的內(nèi)分泌細胞等特定器官分泌，是一種微量生物活性物質(zhì)。類固醇激素通過血液運輸?shù)狡渌鞴?，有調(diào)節(jié)、控制組織器官生理活動和代謝機能的作用，并對各種生理機能和代謝過程起著重要的協(xié)調(diào)作用。乳制品中殘留激素通過食物鏈進入人體會產(chǎn)生一系列健康危害，如導(dǎo)致代謝失調(diào)、生長發(fā)育障礙和缺陷、出生缺陷、致癌、致畸等[8-9]。乳制品中類固醇激素的殘留在國內(nèi)外已成為獸藥殘留問題關(guān)注的重點。

目前已有針對激素殘留對消費者健康潛在風(fēng)險的研究。越來越多的證據(jù)表明，即使是接觸微量的激素類物質(zhì)，也可能對動物和人類構(gòu)成潛在風(fēng)險。雄激素和孕激素均被認為是可能對人類致癌的物質(zhì)。歐盟1996年明令禁止畜牧業(yè)使用具有促生長作用的激素。我國2019年頒布中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號法令，禁止合成類固醇激素在食品動物中的應(yīng)用。因此，為保護人類健康免受激素的危害，應(yīng)采取適當(dāng)?shù)拇胧z測動物基質(zhì)中這些化合物的含量。已經(jīng)有研究檢測了多種生物基質(zhì)，如牛乳、肉、血清、頭發(fā)、皮膚、脂肪和血漿中的激素含量[10-12]。乳制品作為廣泛食用的食品，是研究最多的基質(zhì)之一。

1 類固醇激素的結(jié)構(gòu)、分類及其功能

類固醇激素結(jié)構(gòu)源于膽固醇，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，由3 個六元環(huán)和1 個五元環(huán)構(gòu)成，通過六元環(huán)-六元環(huán)-六元環(huán)-五元環(huán)的方式排列。類固醇激素結(jié)構(gòu)以該類化學(xué)骨架為基礎(chǔ)，通過鏈斷裂、開環(huán)或環(huán)收縮形成其他骨架，同樣是C18和C19位置有2 個甲基，膽固醇脫掉部分側(cè)鏈即為21 個碳原子的類固醇激素-孕激素和腎上腺皮質(zhì)激素，膽固醇脫掉整個側(cè)鏈即為19 個碳原子的類固醇激素雄性激素，膽固醇脫掉C18位置甲基，第1個六元環(huán)轉(zhuǎn)化為芳香酚結(jié)構(gòu)形成雌激素；類固醇激素的結(jié)構(gòu)區(qū)別主要在于環(huán)形結(jié)構(gòu)上的官能團和環(huán)形結(jié)構(gòu)的氧化態(tài)，同時，類固醇結(jié)構(gòu)中官能團的立體異構(gòu)性決定了不同的生物活性，如α-雌二醇和β-雌三醇[13]。

圖1 膽固醇化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of cholesterol

根據(jù)生物活性和藥理作用類固醇激素可分為兩大類：性激素和腎上腺皮質(zhì)激素（表1）。性激素是由動物性腺、腎上腺和調(diào)控器官產(chǎn)生，可促進第二性征發(fā)育、性別差異、維持性功能和促進動物體代謝。性激素可細分為雌激素、雄激素和孕激素。腎上腺皮質(zhì)激素主要是由哺乳動物脊椎腎上腺皮層產(chǎn)生，可細分為鹽皮質(zhì)激素和糖皮質(zhì)激素。乳制品生產(chǎn)加工過程中主要涉及糖皮質(zhì)激素，如氫化可的松、潑尼松龍和地塞米松等。

表1 類固醇激素分類及代表性激素[5,13-14]Table 1 Classification and representatives of steroid hormones[5,13-14]

類固醇激素按照來源可分為人工合成類和天然類兩大類。天然類固醇激素主要由動物的雌性、雄性性器官和腎上腺素器官產(chǎn)生，是影響動物生長發(fā)育的重要物質(zhì)之一。天然類固醇激素和人工合成類固醇激素均可分為雄激素、雌激素和孕激素。天然激素，如雌二醇、睪酮或孕酮通過口服或腸道外給藥會失效。人工合成類固醇激素主要用于治療器官病變導(dǎo)致的疾病或用于促進生長發(fā)育。人工合成類固醇激素的給藥途徑與天然激素不同，該類激素通常以酯衍生物的形式通過肌肉注射或耳朵附近植入給藥，經(jīng)過吸收、水解或異構(gòu)化后，易在體液中轉(zhuǎn)運至外周血；人工合成類固醇激素在動物體內(nèi)很難分解，通過食物鏈進入人體后，可擾亂人體內(nèi)分泌系統(tǒng)[14]。

2 乳制品中類固醇激素限量標準

美國、英國、中國等國家均規(guī)定了動物源性食品中糖皮質(zhì)激素的最大殘留量，部分糖皮質(zhì)激素還被規(guī)定為違禁藥物[15]。歐盟規(guī)定，牛的肌肉、肝臟、腎臟和牛乳中潑尼松龍的最大殘留限量分別為4、10、10、6 μg/kg。2020年發(fā)布的中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告235號法令《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定，地塞米松在牛、豬、馬的肌肉和腎臟中的最大殘留限量為0.75 μg/kg，在肝臟中的最大殘留限量為0.75 μg/kg，在牛乳中的最大殘留限量為0.3 μg/kg[16]。歐盟禁止在食用動物中使用氫化可的松。中國、歐盟和國際食品法典委員會并未對牛乳和其他乳制品中的氫化可的松殘留量設(shè)定限值。日本已制定法規(guī)要求，食品中氫化可的松的最大殘留限量為10 μg/kg。

國際食品法典委員會對醋酸甲羥孕酮在動物肝臟中的最大殘留限量設(shè)定為10 μg/kg，對牛乳中睪酮、孕酮的最大殘留限量未作限制。美國食品藥品監(jiān)督管理局、歐盟規(guī)定，雌激素不可以作為促生長劑在畜牧業(yè)中使用。中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告235號法令明確規(guī)定：醋酸甲羥孕酮、甲基睪丸酮等為禁用獸藥；苯甲酸雌二醇、丙酸睪酮為治療允許藥物，但不得在牛乳中檢出；雌二醇等雌激素列為禁用藥物，食品中不得檢出。世界衛(wèi)生組織根據(jù)200 mg/d（3.3 mg/kg體質(zhì)量）的最低觀察效應(yīng)水平得出孕酮的可接受每日攝入量（acceptable daily intake，ADI）為30 μg/kg體質(zhì)量[15]。不同國家、機構(gòu)針對牛乳中激素允許的最大殘留限量見表2。

表2 中國、美國、歐盟、國際食品法典委員會和日本對牛乳中激素的最大殘留限量比較Table 2 Maximum residue limits for hormones in milk in China, USA,EU, Codex Aalimentarius Commission and Japanμg/kg

3 乳制品中類固醇激素檢測方法

國內(nèi)外針對乳制品中類固醇激素的研究較多[17-19]，本節(jié)主要討論檢測方法中的前處理方法和儀器方法。

由于乳制品樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，乳制品中類固醇激素的前處理方法主要包括固相萃取、固相微萃取、基質(zhì)固相分散和QuEChERS（quick, easy, cheap, effective,rugged, safe）等[20-24]。

類固醇激素的檢測方法主要為酶聯(lián)免疫法和色譜分析法，其中酶聯(lián)免疫法假陽性率高，只能用于定性初篩[25]。Kolanvic等[26]驗證了酶聯(lián)免疫法篩查對牛乳中地塞米松、倍他米松、氟米松和潑尼松龍4 種激素的有效性。色譜分析法可用于類固醇激素的精準定量，主要包括高效液相色譜-串聯(lián)紫外色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[27]。Qin Hui等[28]采用高效液相色譜-串聯(lián)紫外色譜法分析牛乳樣品中的3 種腎上腺皮質(zhì)激素（二丙酸倍氯米松、丁酸氫化可的松和苯丙酸諾龍）。劉東等[29]采用通過式固相萃取對牛乳和乳粉中4 種類固醇激素進行前處理，然后采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛乳和乳粉中4 種類固醇激素，檢出限為0.4～2.0 μg/kg，定量限為0.8～4.0 μg/kg，加標回收率為85%～115%。田海偉等[30]通過QuEChERS前處理方法，實現(xiàn)牛乳中18 種糖皮質(zhì)激素的同時檢測，然后通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在多反應(yīng)監(jiān)測模式下進行定性和定量分析，實現(xiàn)牛乳中18 種糖皮質(zhì)激素的同時檢測。該方法的基質(zhì)效應(yīng)為0.81～0.96，方法檢出限為0.1～0.3 μg/kg，定量限為0.3～1.1 μg/kg，0.5～100.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，3 個水平下加標回收率為73.7%～98.6%，相對標準偏差為4.9%～12.9%（n=5）。該方法簡單、快捷、準確、可靠，適合于大批量牛乳樣品中糖皮質(zhì)激素的快速檢測。D’Orazio等[31]采用中空纖維液相微萃取法及氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測定牛乳和酸乳樣品中的雌激素化合物，方法校準曲線的相關(guān)系數(shù)大于0.991，全脂牛乳的檢測限和定量限分別為0.06～2.55 μg/L和0.16～6.11 μg/L，半脫脂山羊乳的檢測限和定量限分別為0.04～1.70 μg/L和0.11～4.86 μg/L，天然酸乳的檢測限和定量限分別為0.07～3.73 μg/L和0.23～9.81 μg/L。

色譜分析法檢測準確、重現(xiàn)性好，尤其是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是目前類固醇激素的標準檢測方法?，F(xiàn)有的3 項有關(guān)類固醇激素的檢測標準：GB/T 21981—2008《動物源食品中激素多殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》，農(nóng)業(yè)部1031號公告-1—2008《動物源性食品中11 種激素殘留檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》和農(nóng)業(yè)部1031號公告-2—2008《動物源性食品中糖皮質(zhì)激素類藥物多殘留檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》均采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法完成定量。

4 乳制品中類固醇激素含量研究進展

Chen Chen等[32]對北京市售乳制品中天然存在的雌激素含量展開研究，選擇26 個品類超高溫滅菌（ultrahigh temperature，UHT）乳、4 個品類巴氏殺菌乳、6 個品類嬰幼兒配方乳粉和2 個品類全脂乳粉。結(jié)果表明：不同乳制品中雌酮含量為：UHT牛乳3.52～19.36 ng/L，巴氏殺菌乳小于檢測限，為22.49 ng/L，嬰兒配方乳粉26.78～146.12 ng/L，全脂乳粉10.35～10.38 ng/L；17α-雌二醇含量為：UHT牛乳0.95～12.61 ng/L，巴氏殺菌乳小于檢測限，為28.24 ng/L，嬰兒配方乳粉7.98～35.00 ng/L，全脂乳粉24.27～28.34 ng/L；17β-雌二醇含量為：UHT牛乳小于檢測限，為36.00 ng/L，巴氏殺菌乳小于檢測限，為44.24 ng/L，嬰兒配方乳粉19.16～37.72 ng/L，全脂乳粉58.59～70.12 ng/L；雌三醇含量為：UHT牛乳小于檢測限，為2.18 ng/L，巴氏殺菌乳、嬰兒配方乳粉和全脂乳粉均小于檢測限。陳曉鵬等[16,33]采用QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分別對中國市場銷售的24 個乳粉樣品和24 個牛乳樣品進行42 種類固醇激素殘留量檢測，結(jié)果顯示，48 個乳制品中除了孕酮外其他41 種類固醇激素均未檢出，其中乳粉中孕酮的檢出量為0.6～23.8 μg/kg，牛乳中孕酮的檢出量為0.3～0.8 μg/kg。韓超男等[34]采用同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法完成20 份牛乳中睪酮、孕酮及氫化可的松3 種類固醇激素的檢測，20 份牛乳樣品中均含有孕酮，含量為1.33～16.19 μg/kg，19 份牛乳樣品中檢出氫化可的松，含量為0.14～1.02 μg/kg，未超出國家規(guī)定的10 μg/kg限量標準，樣品均未檢出睪酮?？嫡际35]建立凝膠凈化色譜-超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定乳粉中的潑尼松、波尼松龍、氫化可的松、地塞米松和倍他米松含量，15 種乳粉中均未檢測到以上化合物；建立嬰幼兒配方乳粉中6 種雌激素（已烯雌酚、17α-乙炔基雌二醇、17α-雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇和雌酮）的氣相色譜-質(zhì)譜分析方法，26 份嬰幼兒配方乳粉中17α-雌二醇的含量為0.10～4.49 μg/kg，1 個樣品中檢出17β-雌二醇，含量為0.17 μg/kg，3 個樣品中檢出雌三醇，含量均為0.19 μg/kg，未檢出己烯雌酚、雌酮和炔雌醇。

不同乳制品中類固醇激素含量見表3。

表3 不同乳制品中類固醇激素含量Table 3 Contents of steroid hormones in different dairy products

5 乳制品中類固醇激素健康風(fēng)險研究

乳制品中的激素對人體內(nèi)分泌系統(tǒng)生理功能會有一定影響，已引起科研界和工業(yè)界的關(guān)注[37]。在乳制品中類固醇激素對健康風(fēng)險研究方面，已有一些研究報道可供參考。Qu Xueyin等[36]對河北省唐山市原料乳中天然存在的類固醇激素健康風(fēng)險開展調(diào)查。基于該研究所得數(shù)據(jù)，當(dāng)暴露于該研究中檢測的牛乳中類固醇激素（僅檢測到氫化可的松和孕酮）濃度時，預(yù)計1～5 歲的兒童將成為高危人群。根據(jù)牛乳中檢測到的氫化可的松孕酮平均濃度和最大濃度，以及男孩和女孩每日攝入量估算，結(jié)果表明，所檢測的原料乳中類固醇激素濃度不會對幼兒構(gòu)成健康風(fēng)險。Chen Chen等[32]對北京市售乳制品中天然存在的雌激素的潛在暴露風(fēng)險開展初步評估。基于所檢測的不同乳制品中雌酮、17α-雌二醇、17β-雌二醇和雌三醇濃度計算出通過牛乳攝入的雌激素暴露量和毒理學(xué)關(guān)注閾值分別為99～1 700 000和6.1～3 177，以確定來自牛乳的雌激素攝入量是否符合毒理學(xué)限制要求。結(jié)果表明，牛乳中可能存在的單個雌激素和總雌激素不會對當(dāng)?shù)鼐用瘢òㄓ變海┰斐山】碉L(fēng)險。

6 結(jié) 語

本文系統(tǒng)介紹了類固醇激素的結(jié)構(gòu)、分類及功能，乳制品中類固醇激素檢測方法、限量標準、含量及健康風(fēng)險研究進展。隨著高效前處理技術(shù)和檢測技術(shù)的發(fā)展，類固醇激素檢測方法近些年有較大突破。近年來，QuEChERS前處理方法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法成為使用最廣泛的技術(shù)。乳制品中類固醇含量較低，開發(fā)高靈敏度的檢測方法仍是今后主要研究目標。

近期研究主要基于美國、歐盟、中國等國家和組織針對類固醇激素所制定的限量標準，根據(jù)所檢測乳制品中類固醇激素含量，研究不同人群的暴露風(fēng)險。由于乳制品中類固醇激素檢出類別較少，暴露風(fēng)險評估覆蓋面較小。開發(fā)具有高靈敏度的檢測方法，可增加類固醇激素的檢出類別，進而增加暴露風(fēng)險評估覆蓋面。