張雅倫，楊 帆，張 濤，張 瑞，李 獻，周 巍，張 巖

（河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，國家市場監(jiān)督管理重點實驗室（特殊食品監(jiān)管技術），特殊食品安全與健康河北省工程研究中心，河北 石家莊 050071）

單核細胞增生李斯特氏菌（以下簡稱“單增李斯特菌”）是一種人畜共患病的病原菌，動物性食品是傳播食源性人畜共患病病原菌的主要媒介，由該菌引起的疾病稱為李斯特菌病[1-2]。有研究報道，生鮮畜禽肉中單增李斯特菌的檢出率為10.9%～27.2%，顯著高于熟肉制品（4.61%），被認為是該菌的主要來源[3]。由于單增李斯特菌可存在于食品加工處理各個環(huán)節(jié)的環(huán)境中，并在低溫下仍能生長存活，使得該菌的控制具有一定的難度[4-5]。近年來有在乳制品、嬰幼兒食品、冷飲、米面制品中檢出單增李斯特菌的報道[6-9]。在過去的近30 年里，國際上多起暴發(fā)和散發(fā)的李斯特菌病病例被證實與熱狗、意大利香腸、巴氏殺菌牛乳、沙拉、生食蔬菜、冰激凌、干酪及未煮熟的魚等食品有關，該病臨床表現(xiàn)多樣化，如胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等，最易感染孕婦、嬰兒及免疫力低下者[10-12]。食源性李斯特菌病致死率高達30%以上[13]，單增李斯特菌被世界衛(wèi)生組織列為20世紀90年代四大食品致病菌之一[14]。

目前食品中單增李斯特菌的檢測主要以分離培養(yǎng)和生化鑒定為主，而傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)和鑒定是一項既耗時又復雜的工作，由于某些生化試劑、血清等質(zhì)量不穩(wěn)定、特異性不好等因素，常給鑒定結果帶來差異，這勢必極大影響食品的安全管理和有效監(jiān)測?？焖佟蚀_鑒定食源性微生物是食品微生物檢驗的一項基本要求?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（以下簡稱飛行時間質(zhì)譜）具有前處理簡單和高通量的特點[15-16]，可以實現(xiàn)對未知微生物的快速鑒定、分型、溯源等[17-18]。雖然單增李斯特菌可以使用飛行時間質(zhì)譜快速鑒定[19-21]，但質(zhì)控樣品仍缺失，嚴重限制了我國食品微生物質(zhì)譜檢測發(fā)展。

本研究通過真空冷凍干燥技術制備單增李斯特菌定性質(zhì)控樣品，并系統(tǒng)分析質(zhì)控樣品的均勻性和穩(wěn)定性。通過優(yōu)化凍干基質(zhì)條件，得到制備質(zhì)控樣品的最佳條件。通過培養(yǎng)計數(shù)和飛行時間質(zhì)譜技術，驗證定性質(zhì)控樣品的均勻性和穩(wěn)定性。旨在提高鑒定的準確性，減少我國各研究機構對單增李斯特氏菌國外質(zhì)控樣品的依賴，提升食品安全突發(fā)事件的處置能力和風險監(jiān)測預警能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單核細胞增生李斯特氏菌CMCC 54009 中國食品檢驗研究院。

乙醇（質(zhì)譜純）、甲酸（質(zhì)譜純）、乙腈（質(zhì)譜純）、蔗糖（相對分子質(zhì)量40 000）、葡聚糖 天津科密歐化學試劑有限公司；1640細胞培養(yǎng)基 美國Sigma公司；質(zhì)譜靶板基質(zhì)液 德國Bruker公司。

1.2 儀器與設備

MS3振蕩混勻器 美國IKA公司；BHC-300IIA/B3生物安全檢驗柜 蘇州凈化儀器設備有限公司；MIR-254恒溫培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；HVE-50滅菌器日本Hirayama公司；3K15冷凍離心機 德國Sigma公司；autoflex maX LIN飛行時間質(zhì)譜儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 凍干基質(zhì)的篩選

質(zhì)控樣品的穩(wěn)定性受保護劑種類、菌株的生理狀態(tài)及其復水條件等因素影響，其中保護劑種類是影響質(zhì)控樣品穩(wěn)定性最重要的因素。將單增李斯特菌按照不同凍干基質(zhì)條件進行真空冷凍干燥后加入1 mL無菌水，使樣品復水溶解，測定存活率，凍干存活率按下式計算。

選用基質(zhì)種類分別為1640細胞培養(yǎng)基、蔗糖、葡聚糖、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、脫脂乳粉，按照不同比例配制不同基質(zhì)進行研究。

1.3.1.1 脫脂乳粉和蔗糖

分別配制質(zhì)量濃度為5、10、15 g/100 mL的脫脂乳粉，對應配制不同質(zhì)量分數(shù)（5%、10%、15%、20%）的蔗糖為凍干基質(zhì)，按照1.3.2節(jié)進行樣品制備，并使用無菌生理鹽水使其復溶，測定存活率，篩選凍干基質(zhì)。

1.3.1.2 1640細胞培養(yǎng)基

選取1640細胞培養(yǎng)基作為基礎原料，其他凍干基質(zhì)為蔗糖、葡聚糖、BSA。蔗糖質(zhì)量分數(shù)使用1.3.1.1節(jié)得到的結果，對葡聚糖（2%、4%、6%、8%、10%）和BSA（1%、3%、5%、10%）的比例進行研究，按照1.3.2節(jié)進行樣品制備，并使用無菌生理鹽水使其復溶，測定存活率，篩選凍干基質(zhì)。

1.3.2 單增李斯特菌質(zhì)控樣品制備

將單增李斯特菌劃線接種于PCA平板上，36 ℃培養(yǎng)24 h。用無菌棉簽從平板上刮取菌苔混懸于凍干保護劑中，使用紫外分光光度計，測定波長為650 nm，調(diào)節(jié)菌濃度使OD650nm為2.3，使用微量移液器將100 μL菌懸液均勻滴入加有液氮的西林瓶中，放入真空冷凍干燥機中，預凍程序為-20 ℃、200 min，-40 ℃、200 min；冷凍干燥程序為-35 ℃、360 min，真空度130 mTorr；-30 ℃、360 min，真空度130 mTorr；-25 ℃、480 min，真空度130 mTorr；-20 ℃、480 min，真空度130 mTorr；-10 ℃、480 min，真空度130 mTorr。程序結束時保存為-20 ℃、真空度100 mTorr狀態(tài)，制備質(zhì)控樣品。

1.3.3 單增李斯特菌質(zhì)控樣品均勻性驗證

采用簡單隨機抽樣方式，每個樣品隨機編號，抽取20 瓶樣品，對質(zhì)控樣品進行定量檢驗，輔助驗證均勻性。隨機樣品中分別加入1 mL無菌水，使樣品復溶，使用加樣系統(tǒng)在平板上均勻涂布，每個質(zhì)控樣品做2 個平行，放置于（36±1） ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定單增李斯特菌數(shù)量。

1.3.4 單增李斯特菌質(zhì)控樣品穩(wěn)定性驗證

1.3.4.1 運輸穩(wěn)定性驗證

將制備好的單增李斯特菌質(zhì)控樣品放置于37 ℃和25 ℃環(huán)境中，進行14 d的運輸穩(wěn)定性研究，分別在0、1、2、3、5、7、14 d進行驗證，同時做3 次平行實驗。通過單增李斯特菌數(shù)量變化驗證樣品在較高溫度下的運輸穩(wěn)定性，確定能否作為質(zhì)控樣品進行實際發(fā)樣運輸。

1.3.4.2 貯藏穩(wěn)定性驗證

將質(zhì)控樣品放置于4 ℃和-20 ℃條件下，進行28 d的貯藏穩(wěn)定性研究。穩(wěn)定性檢驗的時間間隔可以按先密后疏的原則安排。分別在貯藏0、1、3、5、7、14、28 d進行驗證，同時做3 次平行實驗。通過復蘇率驗證樣品在低溫下的貯藏穩(wěn)定性。

1.3.4.3 飛行時間質(zhì)譜測定穩(wěn)定性驗證

分別將樣品在37 ℃和-20 ℃環(huán)境中保存28 d后進行飛行時間質(zhì)譜測定，導入BN軟件進行分析整合，研究質(zhì)控樣品飛行時間質(zhì)譜測定穩(wěn)定性。

1.3.5 單增李斯特菌質(zhì)控樣品飛行時間質(zhì)譜測定

將制備的質(zhì)控樣品進行飛行時間質(zhì)譜測定時可以直接溶解使用，無需再次培養(yǎng)。

1.3.5.1 樣品前處理

將密封的質(zhì)控樣品開啟，將凍干菌球取出放入離心管內(nèi)，加入100 μL滅菌水使其復溶，以12 500 r/min離心5 min，去除上清液，保留沉淀，重復進行3 次。

1.3.5.2 樣品靶板制作

向沉淀中添加50 μL體積分數(shù)70%甲酸，充分裂解2 min，添加50 μL乙腈，充分溶解后，以12 500 r/min離心5 min，取1 μL上清液到靶板相應位置，靜置，待溶液揮發(fā)完成，取1 μL質(zhì)譜靶板基質(zhì)液到同樣位置，靜置，待溶液揮發(fā)完成，進行飛行時間質(zhì)譜測定。根據(jù)質(zhì)譜儀得到單增李斯特菌的特征質(zhì)譜圖和蛋白指紋峰，進一步進行穩(wěn)定性研究。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS軟件，采用單因素方差分析方法對質(zhì)控樣品均勻性進行分析。

2 結果與分析

2.1 凍干基質(zhì)的篩選結果

保護劑種類繁多，由于菌株本身特性不同導致保護劑種類和使用量會發(fā)生變化。

2.1.1 脫脂乳粉和蔗糖

由表1可知，5 g/100 mL脫脂乳粉、15%蔗糖保護劑的凍存效果最好，凍干存活率為93%。但在后續(xù)飛行時間質(zhì)譜檢測中，在m/z2 000～20 000出現(xiàn)了溶劑雜峰，影響了對目標菌的檢測，因此不能用脫脂乳粉作保護劑。

表1 脫脂乳粉和蔗糖作為保護劑時單增李斯特菌的凍干存活率Table 1 Survival rate of freeze-dried Listeria monocytogenes with skim milk powder or sucrose as lyoprotectant%

2.1.2 1640 細胞培養(yǎng)基

因脫脂乳粉無法使用，選取1640細胞培養(yǎng)基作為基礎原料。由表2可知，8%葡聚糖、5% BSA保護劑的凍存效果最好，凍干存活率為95%。但是加入BSA后，在后續(xù)飛行時間質(zhì)譜檢測中也在m/z2 000～20 000出現(xiàn)了溶劑雜峰，影響了對目標菌的檢測，所以需要去除BSA。

表2 1640細胞培養(yǎng)基作為保護劑時單增李斯特菌的凍干存活率Table 2 Survival rate of freeze-dried Listeria monocytogenes using 1640 culture medium with glucan and BSA as lyoprotectant%

2.1.3 多次實驗驗證結果

得到篩選過后的凍干溶劑為1640細胞培養(yǎng)基，其中蔗糖質(zhì)量分數(shù)為15%，葡聚糖質(zhì)量分數(shù)為8%，進行重復驗證。由表3可知，最高存活率為95%，且沒有出現(xiàn)溶劑雜峰影響飛行時間質(zhì)譜檢驗，所以可以作為凍干菌球的保護劑。

表3 篩選過后的1640細胞培養(yǎng)基作為保護劑時單增李斯特菌的凍干存活率Table 3 Survival rate of freeze-dried Listeria monocytogenes using 1640 culture medium with 15% sucrose and 8% glucan as lyoprotectant

2.2 單增李斯特菌質(zhì)控樣品均勻性驗證結果

由表4可知，20 瓶單增李斯特菌質(zhì)控樣品計數(shù)結果較為統(tǒng)一，沒有發(fā)生太大波動，說明樣品均勻性良好。

表4 20 瓶單增李斯特菌質(zhì)控樣品計數(shù)結果Table 4 Results of cell counting of 20 quality control samples of Listeria monocytogenes 107 CFU

使用SPSS軟件，采用單因素方差分析方法，對樣品的均勻性進行檢驗。通過分析F分布臨界值表得知，F(xiàn)INV（0.05，19，20）臨界值=2.137，由表5可知，根據(jù)SPSS軟件計算的F=0.567＜FINV（0.05，19，20）臨界值，菌株計數(shù)穩(wěn)定，側面驗證定性結果均一，表明該樣品均勻性符合要求。

表5 樣品的均勻性分析Table 5 Homogeneity analysis of samples

2.3 單增李斯特菌質(zhì)控樣品穩(wěn)定性驗證結果

2.3.1 運輸穩(wěn)定性驗證結果

由表6可知，質(zhì)控樣品在37 ℃放置14 d后，單增李斯特菌計數(shù)仍維持在107CFU，在25 ℃環(huán)境下，質(zhì)控樣品計數(shù)較37 ℃更加穩(wěn)定，證明質(zhì)控樣品運輸穩(wěn)定性良好。

表6 質(zhì)控樣品模擬運輸穩(wěn)定性實驗結果Table 6 Stability of quality control samples under simulated transportation conditions

2.3.2 貯藏穩(wěn)定性驗證結果

由表7可知，質(zhì)控樣品在-20 ℃放置28 d復蘇率為101.5%，在4 ℃放置28 d復蘇率為99.6%，說明單增李斯特菌質(zhì)控樣品貯藏穩(wěn)定性良好。

表7 質(zhì)控樣品貯藏穩(wěn)定性實驗結果Table 7 Storage stability of quality control samples

2.3.3 飛行時間質(zhì)譜測定穩(wěn)定性驗證結果

由圖1～2及表8可知，在不同溫度條件下用飛行時間質(zhì)譜檢測單增李斯特菌質(zhì)控樣品，結果穩(wěn)定，譜圖一致，說明質(zhì)控樣品飛行時間質(zhì)譜測定穩(wěn)定性良好，可以作為陽性質(zhì)控樣品在飛行時間質(zhì)譜檢驗中使用。

表8 -20 ℃和37 ℃條件下質(zhì)控樣品飛行時間質(zhì)譜特征峰數(shù)據(jù)比較Table 8 Comparison of characteristic mass spectral peak data of quality control samples at -20 and 37 ℃

圖1 質(zhì)控樣品在-20 ℃條件下的飛行時間質(zhì)譜圖Fig.1 Time-of-flight mass spectrum of quality control sample at -20 ℃

圖2 質(zhì)控樣品在37 ℃條件下的飛行時間質(zhì)譜圖Fig.2 Time-of-flight mass spectrum of quality control sample at 37 ℃

3 結 論

目前食品檢驗研究多集中在致病菌方面，主流檢測方式仍以生化鑒定為主，檢驗周期長、檢測易受主觀因素影響，導致污染控制問題無法有效控制。飛行時間質(zhì)譜作為精準、高通量檢測手段正在逐步應用于日常微生物檢測[22-24]和臨床檢測應用[25-27]，但因沒有相應匹配的質(zhì)控樣品和數(shù)據(jù)庫，嚴重制約了飛行時間質(zhì)譜的發(fā)展[28-29]。

本研究通過優(yōu)化凍干基質(zhì)條件，成功研制出單核細胞增生李斯特氏菌飛行時間質(zhì)譜法定性質(zhì)控樣品，并通過菌落計數(shù)方式輔助驗證質(zhì)控樣品的均勻性和穩(wěn)定性。結果表明：質(zhì)控樣品F=0.567，小于臨界值，均勻性良好，保證了樣品一致性；質(zhì)控樣品在37 ℃和25 ℃環(huán)境中能穩(wěn)定保存，可以保證樣品在運輸過程中不會損壞；質(zhì)控樣品在4 ℃和-20 ℃環(huán)境中能穩(wěn)定保存，說明樣品能夠實現(xiàn)長期貯藏；質(zhì)控樣品在37 ℃和-20 ℃環(huán)境中保存28 d后，飛行時間質(zhì)譜檢測結果一致，說明樣品能夠作為質(zhì)控樣品在飛行時間質(zhì)譜檢驗中穩(wěn)定使用，為推動飛行時間質(zhì)譜技術的發(fā)展提供了技術保障。