趙統(tǒng)秀 李英蘭 婁明遠(yuǎn) 崔曉珊 王佳斌（青海省人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，西寧 810000）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmo?nary disease，COPD）是一種以持續(xù)氣流受限為特征的肺部疾病，氣流受限進(jìn)行性發(fā)展可導(dǎo)致肺源性心臟病和呼吸衰竭。COPD的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，但目前認(rèn)為與肺部對(duì)有毒顆?；驓怏w慢性炎癥反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)［1］。氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺部血管慢性炎癥是COPD的特征性改變，多種免疫細(xì)胞（包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等）均參與COPD發(fā)病過程［2］。CD4+T細(xì)胞在COPD發(fā)病中的作用越來越受到重視。初始CD4+T細(xì)胞在不同轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子作用下可分化為不同的輔助性T細(xì)胞（T helper，Th）亞群，其中，Treg高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FoxP3和CD25，但CD127表達(dá)較低，主要參與機(jī)體免疫耐受。而Th17高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤獨(dú)核受體γt（retinoic acid-related orphan receptorγt，RORγt），并分泌IL-17和IL-22，主要參與機(jī)體炎癥應(yīng)答［3］。由于Treg和Th17在功能上相互制約，兩者比例變化在感染、免疫及炎癥性疾病發(fā)展和預(yù)后中發(fā)揮決定作用［4］。多種因素（包括Toll樣受體、Notch信號(hào)通路、小分子化合物等）在不同疾病過程中均可影響Treg/Th17平衡［5-8］。IL-35是由EB病毒誘導(dǎo)基因3（epstein-Barr virus-induced gene 3，EBI3）和IL-12 p35亞基構(gòu)成的異源二聚體，主要由Treg和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞分泌，促進(jìn)Treg增殖分化并抑制Th17功能［9］。但I(xiàn)L-35在COPD過程中對(duì)Treg/Th17平衡的調(diào)控作用尚未見報(bào)道。因此，本研究檢測(cè)COPD患者IL-35表達(dá)及Treg/Th17變化，并采用體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)觀察外源性IL-35對(duì)COPD患者Treg/Th17平衡的影響。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象選取2020年6月至2020年12月在青海省人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科住院的COPD患者，COPD診斷符合慢性阻塞性肺疾病全球倡議（Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，GOLD，2017年版）標(biāo)準(zhǔn)［10］，包括慢性咳嗽、咳痰、進(jìn)行性呼吸困難、暴露于COPD危險(xiǎn)因素中的病史，有或沒有呼吸窘迫癥狀；第一秒用力呼氣容量（forced expira?tory volume in 1 second，F(xiàn)EV1）與用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）比值<0.7。入選標(biāo)準(zhǔn)：①確診為COPD并完善肺功能檢查；②COPD處于穩(wěn)定期；③入組前2周內(nèi)未接受過抗生素、氧療、糖皮質(zhì)激素或茶堿類藥物治療；④無急性加重期征象；⑤知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①影像學(xué)檢查合并肺部感染；②合并肺間質(zhì)纖維化、結(jié)核、支氣管哮喘或肺部惡性腫瘤；③合并嚴(yán)重心臟疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病或肝臟、腎臟功能不全；④妊娠期婦女。所有患者均根據(jù)改良醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)（modified medical research council，mMRC）呼 吸 困 難 評(píng)分（1999年版）［11］對(duì)COPD患者呼吸困難嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分，0分：僅在用力運(yùn)動(dòng)時(shí)出現(xiàn)呼吸困難；1分：平地快步行走或步行爬小坡時(shí)出現(xiàn)氣短；2分：由于氣短，平地行走時(shí)比同齡人慢或需要停下來休息；3分：在平地行走100 m左右或數(shù)分鐘后需要停下來喘氣；4分：因嚴(yán)重呼吸困難不能離開家，或在穿衣服、脫衣服時(shí)出現(xiàn)呼吸困難。根據(jù)GOLD（2017年版）標(biāo)準(zhǔn)［10］對(duì)COPD患者進(jìn)行嚴(yán)重程度分級(jí)，GOLD-1：預(yù)計(jì)FEV1百分比≥80%；GOLD-2：預(yù)計(jì)FEV1百分比≥50%且<80%；GOLD-3：預(yù)計(jì)FEV1百分比≥30%且<50%；GOLD-4：預(yù)計(jì)FEV1百分比<30%。選擇同期在青海省人民醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康志愿者作為對(duì)照。本研究經(jīng)青海省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（省醫(yī)倫理2019013號(hào)），所有參與者知情同意，一般資料見表1。

表1 COPD患者和對(duì)照者一般資料［例（%）］Tab.1 General characteristics of COPD patients and con?trols［n（%）］

1.1.2 試劑與儀器 淋巴細(xì)胞分離液（美國(guó)Sigma公司）；人CD4+CD25+CD127dim/-Treg分選試劑盒Ⅱ（德國(guó)美天旎公司）；重組人IL-35（美國(guó)Peprotech公司）；抗人CD4-PE Cy5.5、抗CD25-FITC、抗CD127-PE、抗IL-17-APC（美國(guó)BD公司）；人IL-35、IL-10、IL-17、IL-22 ELISA檢測(cè)試劑盒（武漢華美生物公司）；RNA提取試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）；Prime?Script RT reagent Kit（Perfect Real Time，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）；CCK-8試劑盒（武漢碧云天公司）；高速低溫離心機(jī)（美國(guó)西門子公司）；MACS磁力分離架（德國(guó)美天旎公司）；M680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂公司）；FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 血漿和外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）分離于清晨空腹采集COPD患者和健康對(duì)照者外周血20 ml，EDTA抗凝，4℃、1 000 r/min離心10 min，收集上層血漿，-80℃凍存?zhèn)溆?，下層血?xì)胞采用淋巴細(xì)胞分離液、以密度梯度離心法分離PBMC，液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CD4+CD25+CD127dim/-Treg純化采用人CD4+CD25+CD127dim/-Treg分選試劑盒Ⅱ?qū)BMC中的CD4+CD25+CD127dim/-Treg進(jìn)行純化，復(fù)蘇PBMC后采用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活性并計(jì)數(shù)，取1×107個(gè)PBMC于4℃、416 r/min離心10 min，采用CD4+CD25+CD127dim/-T細(xì)胞生物素標(biāo)記抗體雞尾酒Ⅱ剔除CD4-CD127high細(xì)胞，收集CD4+CD127dim/-細(xì)胞，4℃、416 r/min離心10 min，采用CD25磁珠Ⅱ分選CD25+細(xì)胞，得到CD4+CD25+CD127dim/-Treg。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)取1×106個(gè)PBMC加入重組人IL-35（1 ng/ml）刺激培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞和上清，取2×104個(gè)純化的CD4+CD25+CD127dim/-Treg采用重組人IL-35（1 ng/ml）刺激培養(yǎng)24 h，洗滌3次去除外源性IL-35，與自體PBMC分別以1∶1、1∶5和1∶10共培養(yǎng)，加入抗CD3/CD28抗體（1μg/ml）共培養(yǎng)48 h。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMC中CD4+CD25+CD127dim/-Treg和Th17比例取1×105個(gè)PBMC，佛波酯（50 ng/ml）和伊烏諾霉素（1μg/ml）刺激培養(yǎng)6 h，同時(shí)向培養(yǎng)液中加入莫能霉素（10μg/ml）抑制蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。刺激后的PBMC轉(zhuǎn)入FACS管，加入抗人CD4-PE Cy5.5、抗CD25-FITC、抗CD127-PE進(jìn)行表面染色，4℃避光孵育30 min，洗滌，加入破膜固定液，4℃避光孵育30 min，加入抗IL-17-APC進(jìn)行胞內(nèi)染色，4℃避光孵育20 min，洗滌2次，加入含4%多聚甲醛的PBS固定后采用FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀得到細(xì)胞，F(xiàn)lowJo V10軟件分析結(jié)果。

1.2.5 ELISA檢測(cè)血漿IL-35和培養(yǎng)上清中IL-10、IL-17和IL-22表達(dá)采用商品化ELISA試劑盒按說明書檢測(cè)血漿IL-35和培養(yǎng)上清中IL-10、IL-17和IL-22水平，設(shè)置7點(diǎn)標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)本、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各孔相關(guān)細(xì)胞因子濃度。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)FoxP3和RORγt mRNA表達(dá)采用RNA提取試劑盒提取PBMC中的總RNA，PrimeScript RT reagent Kit兩步法試劑盒對(duì)RNA中的FoxP3和RORγt mRNA進(jìn)行半定量分析。反轉(zhuǎn)錄及RT-PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件均嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。PCR引 物 序列 為FoxP3 F：5'-CCTCCCCCAT?CATATCCTTT-3'，F(xiàn)oxP3 R：5'-TTGGGGTTTGTGTT?GAGTGA-3'，RORγt F：5'-AGTCGGAAGGCAAGAT?CAGA-3'，RORγt R：5'-CAAGAGAGGTTCTGGGCAAG-3'，GAPDH F：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，GAPDH R：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。以GAPDH為 內(nèi) 參，2-ΔΔCt法 分 析FoxP3和RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)。

1.2.7 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖細(xì)胞培養(yǎng)的最后4 h向培養(yǎng)液中加入10%CCK-8溶液，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)量490 nm處OD值，以O(shè)D490表示細(xì)胞增殖水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢測(cè)，所有計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COPD患者血漿IL-35水平COPD組與對(duì)照組血漿IL-35水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（108.20±12.13）pg/mlvs（133.30±22.91）pg/ml，t=5.980，P<0.000 1，圖1A］，但<70歲和≥70歲COPD患者血漿IL-35水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（106.00±12.27）pg/mlvs（109.90±11.97）pg/ml，t=1.063，P=0.294 0，圖1B］，吸煙和不吸煙COPD患者差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（107.30±11.29）pg/mlvs（110.30±14.18）pg/ml，t=0.756，P=0.454 0，圖1C］。mMRC評(píng)分為4分的COPD患者血漿IL-35水平顯著低于2分、3分患者［（100.90±12.08）pg/mlvs（115.30±10.03）pg/ml，（111.40±9.78）pg/ml，t=3.066，t=2.851，P=0.005 3，P=0.007 5，圖1D］。GOLD分級(jí)4級(jí)的COPD患者血漿IL-35水平顯著低于2級(jí)、3級(jí)患者［（100.80±12.71）pg/mlvs（114.50±9.81）pg/ml，（111.20±9.67）pg/ml，t=2.912，t=2.714，P=0.007 6，P=0.011 0，圖1E］。

圖1 COPD組和對(duì)照組血漿IL-35水平比較Fig.1 Comparison of plasma IL-35 level in COPD group and control group

2.2 COPD患者Treg/Th17變化采用前向散射光（forward scatter，F(xiàn)SC）和側(cè)向散射光（side scatter，SSC）對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行圈門，在淋巴細(xì)胞門內(nèi)，對(duì)CD4+T細(xì)胞進(jìn)行圈門，在CD4+T細(xì)胞門內(nèi)對(duì)CD25+CD127dim/-細(xì)胞圈門，即為CD4+CD25+CD127dim/-Treg，在CD4+T細(xì)胞門內(nèi)對(duì)IL-17+細(xì)胞圈門，即為Th17（圖2A）。COPD組外周血CD4+CD25+CD127dim/-Treg占CD4+T細(xì)胞的比例顯著低于對(duì)照組［（4.71±1.00）%vs（6.07±1.03）%，t=5.362，P<0.000 1，圖2B］，COPD組外周血Th17占CD4+T細(xì)胞的比例顯著高于對(duì)照組［（2.97±0.72）%vs（2.28±0.61）%，t=4.060，P=0.000 1，圖2C］，COPD組Treg/Th17顯著低于對(duì)照組（1.69±0.60vs2.86±0.91，t=6.279，P<0.000 1，圖2D）。

圖2 COPD組和對(duì)照組外周血CD4+CD25+CD127dim/-Treg、Th17、Treg/Th17比較Fig.2 Comparison of peripheral CD4+CD25+CD127dim/-Treg，Th17 and Treg/Th17 between COPD group and control group

2.3 重組IL-35對(duì)COPD患者PBMC中Treg/Th17、轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和細(xì)胞因子分泌的影響重組人IL-35刺激后CD4+CD25+CD127dim/-Treg占CD4+T細(xì)胞比例顯 著 升 高［（5.31±1.25）%vs（4.71±1.00）%，t=4.157，P=0.000 2，圖3A］，而Th17占CD4+T細(xì)胞比例在無IL-35刺激和經(jīng)IL-35刺激后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（2.97±0.72）%vs（2.85±0.68）%，t=0.867，P=0.391 0，圖3B］，Treg/Th17顯著升高（2.00±0.79vs1.69±0.60，t=2.547，P=0.015 0，圖3C），培養(yǎng)上清中IL-10水平顯著升高［（145.10±24.40）pg/mlvs（123.50±24.11）pg/ml，t=4.520，P<0.000 1，圖3D］，而IL-17水平［（273.40±72.28）pg/mlvs（286.40±65.35）pg/ml，t=0.837，P=0.407 0，圖3E）和IL-22水平在無IL-35刺激和經(jīng)IL-35刺激后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（7.76±1.36）ng/mlvs（8.11±1.35）ng/ml，t=1.128，P=0.266 0，圖3F］，F(xiàn)oxP3 mRNA表達(dá)顯著升高（1.27±0.19vs0.96±0.10，t=7.600，P<0.000 1，圖3G），而RORγt mRNA表達(dá)在無IL-35刺激和經(jīng)IL-35刺激后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.06±0.12vs1.05±0.12，t=0.768，P=0.447 0，圖3H）。

圖3 重組IL-35對(duì)COPD患者PBMC中Treg/Th17、細(xì)胞因子分泌和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響Fig.3 Influence of recombinant IL-35 on Treg/Th17，cy?tokine secretion，and transcription factor expres?sion in PBMC from COPD patients

2.4 重組IL-35對(duì)COPD患者Treg免疫抑制活性的影響取14例COPD患者PBMC，分選CD4+CD25+CD127dim/-Treg，經(jīng)IL-35刺激后與自體PBMC分別以1∶1、1∶5和1∶10共培養(yǎng)48 h，重組IL-35刺激Treg后，Treg抑制PBMC增殖的能力顯著增強(qiáng)（圖4）。

圖4 重組人IL-35對(duì)COPD患者CD4+CD25+CD127dim/-Treg免疫抑制功能的影響Fig.4 Influence of recombinant IL-35 on immunosuppres?sive function of CD4+CD25+CD127dim/-Treg in COPD patients

3 討論

IL-35是一種新發(fā)現(xiàn)的抗炎癥因子，但I(xiàn)L-35在不同炎癥性疾病中的表達(dá)存在差異。在膿毒癥誘導(dǎo)的系統(tǒng)性炎癥、睡眠呼吸暫停綜合征、川崎病等炎癥性疾病中，外周血IL-35水平均升高［12-14］。但在Vogt-小柳原田綜合征、干燥綜合征等自身免疫性疾病中，IL-35水平降低［15-16］。COPD是一種慢性炎癥性疾病，既往研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者外周血IL-35水平顯著降低，且與患者年齡、吸煙史、疾病分期分級(jí)等密切相關(guān)［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者IL-35水平降低，但與患者年齡、吸煙史等無關(guān)，本研究以70歲作為分界點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，由于病例數(shù)較少，可能會(huì)導(dǎo)致患者年齡、吸煙史相關(guān)性判斷產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)偏倚。但I(xiàn)L-35與疾病分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，提示IL-35參與了COPD進(jìn)程，但I(xiàn)L-35在COPD過程中發(fā)揮何種作用尚未闡明。

Treg和Th17失衡在自身免疫性疾病和炎癥性疾病中均發(fā)揮重要作用［3］。Treg和Th17共享TGF-β信號(hào)通路，在TGF-β單獨(dú)作用下，初始CD4+T細(xì)胞分化為Treg；而在IL-6或IL-21聯(lián)合TGF-β共同作用下，初始CD4+T細(xì)胞分化為Th17［3-4］。Treg分泌IL-10和IL-35等抑制性細(xì)胞因子，主要發(fā)揮免疫抑制作用，抑制自身免疫應(yīng)答；而Th17分泌IL-17和IL-22，募集中性粒細(xì)胞等非特異性炎癥細(xì)胞，促進(jìn)感染和炎癥過程，在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮促炎作用［3］。因此，兩類細(xì)胞在炎癥和免疫應(yīng)答中作用完全相反。在斑塊狀銀屑病患者皮損部位Treg/Th17下降，F(xiàn)oxP3水平降低，RORγt水平升高［19］。新型冠狀病毒感染患者中，Treg/Th17、FoxP3/RORγt、IL-10/IL-17均 顯 著 降 低［20］。本 研 究 發(fā) 現(xiàn)，COPD患 者CD4+CD25+CD127dim/-Treg比例降低，Th17比例升高，Treg/Th17降低，與既往在COPD小鼠模型中的研究結(jié)果一致［21-22］。提示COPD患者Treg水平降低，免疫抑制功能下降，而Th17水平升高，誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答，說明Treg/Th17失衡在COPD發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

IL-35在結(jié)締組織病、手足口病、牙周炎中均可調(diào)控Treg/Th17平衡，參與疾病發(fā)病過程［23-25］。IL-35不但可增強(qiáng)Treg的免疫抑制功能，在過敏性鼻炎中還可抑制Th17應(yīng)答［26-27］。但本研究發(fā)現(xiàn)，外源性IL-35刺激COPD患者PBMC后，CD4+CD25+CD127dim/-Treg比例和FoxP3 mRNA水平升高，IL-10分泌增多，但Th17比例、RORγt mRNA水平、IL-17/IL-22水平均無明顯變化，導(dǎo)致Treg/Th17升高，更為重要的是，IL-35刺激后Treg的免疫抑制功能增強(qiáng)，提示IL-35主要影響COPD患者Treg水平和功能，但對(duì)Th17數(shù)量和功能無明顯影響。

本研究具有一定局限性，首先，本研究對(duì)照組病例數(shù)偏少。其次，由于吸煙是COPD發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素之一，導(dǎo)致在有吸煙史和無吸煙史COPD患者血漿IL-35比例中，無吸煙史例數(shù)偏少。因此，本研究結(jié)果仍需要擴(kuò)大樣本量并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

綜上，COPD患者IL-35水平降低無法維持CD4+CD25+CD127dim/-Treg水平和免疫抑制功能，導(dǎo)致Treg/Th17數(shù)量和功能失衡。COPD疾病過程中IL-35可能主要發(fā)揮免疫保護(hù)作用，IL-35可作為COPD治療的潛在靶點(diǎn)之一通過調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答平衡發(fā)揮治療作用。