逄亞寧，楊國平，孟 余，吳利先，李光華

（大理大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學微生物與免疫學教研室，云南 大理 671000）

人類結核病是一種致病菌為結核分枝桿菌，且具有極高的感染率與致死率的傳染病。結核病素有“白色瘟疫”及“頭號殺手”之稱，已成為全球范圍內備受關注的影響人類生活質量的公共衛(wèi)生問題[1，2]。隨著耐藥株的廣泛流行及人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）雙感現(xiàn)狀使得結核病的疫情變得更加嚴峻[3，4]。特別地，隨著近年來新型冠狀病毒的爆發(fā)，使得原本嚴峻的疫情面臨著更大挑戰(zhàn)，面對日趨緊迫的結核病疫情現(xiàn)狀，接種疫苗是一種行之有效的控制方式[5]。卡介苗是目前臨床上唯一用于預防結核病的疫苗，可有效降低兒童結核性腦膜炎及粟粒性結核病的感染，但對成人的保護效果并不理想也并不穩(wěn)定[6]。因此，研制一種免疫效果更加理想的結核病疫苗已成為當務之急。巨噬細胞是結核分枝桿菌的主要宿主細胞，也是機體抵御該病原菌的重要免疫細胞。凋亡是巨噬細胞清除吞噬的結核分枝桿菌的關鍵免疫機制之一，因此可通過巨噬細胞凋亡入手，研制一種更加具有保護效力的疫苗用于結核病的防控[7，8]。線粒體凋亡是真核細胞主要的內源性凋亡途徑，Bcl-2 蛋白家族是線粒體凋亡通路的主要調控因子，Bid 蛋白是Bcl-2蛋白家族中重要的一員，不僅可以結合抗凋亡蛋白抑制其抗凋亡作用，也可以與促凋亡蛋白結合激活其促凋亡作用[9]?；诖耍緦嶒瀸⒔Y核分枝桿菌分泌型蛋白Ag85b 中行使分泌作用的ASP 信號肽基因與促凋亡蛋白Bid 基因相連接，克隆入穿梭質粒pMV261 中。將重組質粒導入恥垢分枝桿菌，構建一株可分泌促凋亡蛋白Bid 的重組恥垢分枝桿菌。由于恥垢分枝桿菌是一種較結核分枝桿菌生長快且無致病性的分枝桿菌，同時與結核分枝桿菌具有高度的基因同源性和相似結構，可表達更多的外源蛋白，因此是一種極具前景意義的結核病疫苗載體。

1 材料與方法

1.1 資料來源 檢索美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），獲得小鼠Bid 蛋白的氨基酸序列。通過ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）和ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）在線軟件預測Bid 蛋白的理化性質；運用TMHMM-2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）與SignalP-4.1（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?Sig nalP-4.1）分析Bid 蛋白的分泌屬性；使用SOPMA（https://npsa -prabi.ibcp.fr/cgi -bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）、SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）生信工具分別預測Bid 蛋白質的二級結構與三級結構；采用NCBI 的CD-Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）工具分析蛋白質Bid 的保守結構域；應用STRING（https://www.string-db.org/）預測小鼠Bid 蛋白的相互作用網絡；經NCBI 數據庫獲得人類蛋白Bid 的氨基酸序列，并利用NCBI 的Blastp（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）預測其與小鼠Bid 蛋白的同源性。

1.2 實驗質粒、菌株、細胞與動物 大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質粒pMV261-10His、結核分枝桿菌標準株H37Rv 基因組、恥垢分枝桿菌Mycolicibacterium Smegmatis mc2155 菌株、大腸桿菌DH5α 菌株、RAW264.7 小鼠巨噬細胞均由大理大學實驗室保存。BALB/c 6～8 周齡雌性小鼠，清潔級別為SPF 級，由大理大學實驗動物中心提供。

1.3 試劑盒與培養(yǎng)基 逆轉錄試劑盒購自全式金生物技術有限公司，普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司，ECL 發(fā)光試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，Middlebrook 7H9 Broth 培養(yǎng)基、Middlebrook 7H10 Agar 培養(yǎng)基購自BD 公司。

1.4 小鼠cDNA 的獲取 頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下解剖小鼠分離獲得脾臟組織，經淋巴細胞分離液做密度梯度離心，使不同比重的細胞按不同的密度梯度離心，得到淋巴細胞。后采用Trizol 法從淋巴細胞提取小鼠RNA，最后通過ONE-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix 試劑盒以RNA 為模板逆轉錄為cDNA。

1.5 pMV261-ASP（BamHI）-10His、pMV261-ASP（BamHI）-Bid-10His、pMV261-ASP（EcoRI）-10His、pMV261-ASP（EcoRI）-Bid-10His 重組質粒的構建以表1 中所列各組基因的上下游引物及酶切位點擴增目的片段，采用無縫克隆技術及傳統(tǒng)酶切酶連技術，將目的基因片段克隆入pMV261-10His 質粒。并將構建的各組質粒分別轉化入大腸桿菌，以pMV261 通用引物P11 與P12 做PCR 擴增及測序共驗證重組質粒是否構建成功。

表1 引物序列

1.6 恥垢分枝桿菌感受態(tài)的制備 挑取新鮮的恥垢分枝桿菌mc2155 單菌落接種于5 ml 的7H9 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 震蕩培養(yǎng)至對數生長期（OD600 為0.5～1.0，1～2 d 左右），以1:100 的比例接種于100 ml 7H9 培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 過夜培養(yǎng)至OD600 為0.6 左右。取出菌液冰上放置30 min～1 h，后于4 ℃，5000 r/min 條件下離心10 min，吸除上清液，收集菌體。并將菌體用預先冰浴的10%無菌甘油洗滌3 次，最后加入10 ml 預冷的10%的甘油，吹打混勻菌體后，每管200 μl 分裝至高壓滅菌的1.5 ml 干凈離心管內，-80 ℃保存。

1.7 重組質粒電轉入恥垢分枝桿菌 抽提經測序正確構建成功的重組質粒：pMV261-ASP（BamHI）-10His、pMV261-ASP（BamHI）-Bid-10His、pMV261-ASP（EcoRI）-10His、pMV261-ASP（EcoRI）-Bid-10His，使用2 mm 的電轉杯，以電壓2.5 kV、電阻1000 Ω、電容25 μF 設置電擊參數，分別電轉導入恥垢分枝桿菌mc2155 感受態(tài)中。將幾組電轉完的恥垢分枝桿菌分別均勻涂布于含有終濃度為20 μg/ml 卡那霉素的7H10 固體培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)3～5 d。

1.8 質粒電轉成功的恥垢分枝桿菌的篩選與鑒定 挑取培養(yǎng)基平板上長出的單菌落，接種于含20 μg/ml卡那霉素的7H9 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 震蕩培養(yǎng)2～3 d。收集菌體煮沸裂解，以裂解液為模板，使用pMV261 通用引物P11、P12，進行PCR 驗證每組質粒是否轉入恥垢分枝桿菌中，并以P11 與P13 為測序引物送測序進一步驗證。

1.9 細胞質與培養(yǎng)基蛋白樣本的收集 將構建成功的幾組重組恥垢分枝桿菌分別接種于含有20 μg/ml卡那霉素的50 ml7H9 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600 為0.6～0.8。各組取50 ml 菌液4000 r/min 離心15 min，使培養(yǎng)基與菌體分離。將培養(yǎng)基上清移入另一離心管，于冰上放置。加入30 ml無菌PBS 溶液重懸菌體，低溫超聲破碎方法破碎菌體，破5 s，停10 s，超聲30 min，10000 r/min 離心15 min，吸取上清即細胞質轉移至另一無菌的離心管中，于冰上放置。將得到的培養(yǎng)基、細胞質樣本分別加入蛋白酶抑制劑，使用0.22 μm 規(guī)格細菌濾器過濾，后經10 kd 規(guī)格的超濾管進行濃縮。

1.10 BCA 蛋白定量法及免疫印跡實驗檢測蛋白表達情況 按照15%的分離膠與5%的濃縮膠制膠，BCA 蛋白定量使每個上樣孔確定5 μg 的上樣量，樣本先在濃縮膠中80 V 恒壓電泳30 min，后改為120 V 電泳至溴酚藍到達分離膠底部，停止電泳。恒流250 mA，30 min 轉膜。將PVDF 膜用TBST 配制的5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。5%脫脂奶粉1∶1500比例稀釋抗His 標簽的一抗，4 ℃孵育過夜。次日將膜用TBST 洗滌4 次，10 min/次。加入以1∶5000 比例稀釋的羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗滌4次，10 min/次。后放入發(fā)光成像儀顯影并分析。

1.11 Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染法流式細胞術檢測Bid 重組恥垢分枝桿菌對RAW264.7 小鼠巨噬細胞凋亡的影響 將收集的RAW264.7 小鼠巨噬細胞吹打重懸，調節(jié)細胞密度至1.5×106個/ml，以1 μg/ml終濃度加入LPS 刺激細胞，將細胞懸液以每個板子2 ml 的量（即3×106個細胞）均勻分至六孔板中，吹打混勻放至37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h 后更換無抗生素的DMEM 完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS），37 ℃培養(yǎng)24 h。收集各組菌樣（Mycolicibacterium Smegmatis mc2155 菌株、含有pMV261-10His 質粒的Mycolicibacterium Smegmatis mc2155 菌株、含有pMV261-ASP（BamHI）-Bid-10His 質粒的Mycolicibacterium Smegmatis mc2155 菌株），以MOI=10 加入各組菌樣分別感染細胞2 h 后，PBS 清洗細胞3次，換上含濃度為50 μg/ml 慶大霉素的DMEM 完全培養(yǎng)基，37 ℃分別繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h。PBS涮洗一遍細胞，加入1 ml 胰酶，37 ℃消化1 min，再加入3 ml DMEM 完全培養(yǎng)基終止胰酶消化。將細胞吹起重懸至15 ml 離心管中，500 G 離心5 min，吸取1 ml預冷至4 ℃的PBS 重懸細胞沉淀并轉移至EP 管中，300 G 離心3 min，再用PBS 重懸，300 G 離心3 min。吸掉PBS 上清，用100 μl 1×binding buffer 重懸細胞轉移至流式細胞管中，并做25 倍稀釋。添加染料在室溫避光孵育10 min 后上機。

2 結果

2.1 小鼠Bid 蛋白質理化性質 ProtParam 生信軟件在線預測小鼠 Bid 蛋白質分子式為C948H1510N272O307S10，總原子數是3047，相對分子質量是21 950.66，等電點是4.80。共含有20 種氨基酸，其中亮氨酸所占比例最高，為11.3%，色氨酸含量最低，為0.5%。帶正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）總數是18，帶負電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）總數為31，不穩(wěn)定系數為57.34，屬于不穩(wěn)定性蛋白質。在280 nm波長處，假如所有半胱氨酸殘基成對形成胱氨酸，則其消光系數為8605，吸光度為0.392；如若所有半胱氨酸消失，則其消光系數為8480，吸光度為0.386。Bid 半衰期是30 h，脂肪系數是86.05，總平均親水性是-0.419。通過ProtScale 進一步分析小鼠Bid 蛋白質親水性，親水性氨基酸數量多于疏水性氨基酸，提示小鼠Bid 蛋白為親水性蛋白質。

2.2 小鼠Bid 蛋白質跨膜結構域與信號肽 經TMHMM -2.0 工具分析小鼠Bid 蛋白不存在跨膜結構域（圖1）。運用SignalP-4.1 預測軟件分析小鼠Bid 蛋白不含有信號肽結構（圖2），綜合分析小鼠Bid 蛋白不屬于分泌性蛋白質。

圖1 小鼠Bid 蛋白質跨膜區(qū)域預測

圖2 小鼠Bid 蛋白質信號肽預測

2.3 小鼠Bid 蛋白質二級結構與三級結構 SOPMA預測小鼠Bid 蛋白的二級結構中，α-螺旋（Hh）、無規(guī)則卷曲（Cc）、β-折疊（Ee）、β-轉角（Tt）所占比例依次為65.13%、27.69%、4.10%、3.08%。SWISSMODEL 對小鼠Bid 蛋白進行同源建模并對其三級結構加以預測，見圖3。

圖3 小鼠Bid 蛋白質三級結構預測

2.4 小鼠Bid 蛋白質保守結構域 利用NCBI 的CDSearch 工具預測到小鼠Bid 基因轉錄翻譯的第3～192 個氨基酸區(qū)域屬于Bid 超家族，含有BH3 死亡結構域，該蛋白家族是程序性細胞死亡的關鍵調控因子。

2.5 小鼠Bid 蛋白質相互作用網絡 應用STRING 軟件預測小鼠Bid 蛋白可與Caspase8、Bcl2l1、Bax、Mcl-1、Bak1、Bcl2a1a、Bcl-2、Granzyme B、Caspase2、Capn2 蛋白質發(fā)生相互作用。

2.6 小鼠Bid 蛋白質與人類Bid 蛋白質同源性 采用美國國家生物信息中心的Blastp 工具預測得到小鼠Bid 蛋白質與人類蛋白質相似性為64%。

2.7 PCR 擴增ASP 與Bid 基因片段結果 以結核分枝桿菌標準株H37Rv 基因組為模板擴增的pMV261-ASP（BamHI）-10His 質粒中的ASP 片段應為154bp，pMV261-ASP（EcoRI）-10His 質粒中的ASP 片段為140 bp，pMV261-ASP（BamHI）-10His中間載體質粒中ASP 片段為154 bp。以小鼠cDNA為模板擴增的pMV261-ASP（BamHI）-Bid-10His 質粒中的Bid 片段為619 bp，pMV261-ASP（EcoRI）-Bid-10His 質粒中的Bid 片段為619 bp。PCR 擴增后電泳結果見圖4，顯示各基因片段均擴增成功。

圖4 PCR 擴增ASP 與Bid 基因

2.8 重組質粒構建結果 從大腸桿菌抽提pMV261-ASP（BamHI）-10His 中間載體質粒，大小為4632 bp，電泳結果見圖5。抽提的pMV261-ASP（BamHI）-10His 質粒、pMV261-ASP（EcoRI）-10His 質粒、pMV261-ASP（BamHI）-Bid-10His 質粒、pMV261-ASP（EcoRI）-Bid-10His 質粒大小依次為4626 bp、4641 bp、5217 bp、5232 bp，電泳結果見圖6。電泳結果顯示質粒大小均在相應條帶處且均為超螺旋結構，各組質粒經進一步測序驗證結果均無誤，即重組質粒構建成功。

圖5 抽提pMV261-ASP（BamHI）-10His中間載體質粒（4632bp）電泳

圖6 大腸桿菌抽提構建成功質粒的電泳

2.9 重組質粒電轉恥垢分枝桿菌PCR 驗證結果 以各組菌株裂解液為模板，以pMV261 質粒上的通用引物P11 與P12，作相應片段的PCR 擴增及電泳，初步驗證重組質粒電轉結果。pMV261-ASP（EcoRI）-10His、pMV261-ASP（BamHI）-10His、pMV261-ASP（BamHI）-Bid-10His、pMV261-ASP（EcoRI）-Bid-10His 組擴增片段大小分別應為607 bp、592 bp、1183 bp、1198 bp。電泳結果顯示各組質粒均成功轉入Mycobacterium smegmatis mc2155 菌株中，后經測序進一步驗證也均無誤，即各組質粒均完整的導入了恥垢分枝桿菌，見圖7。

圖7 重組質粒電轉恥垢分枝桿菌PCR 驗證

2.10 目標蛋白在培養(yǎng)基與細胞質中表達情況 免疫印跡實驗結果見圖8 與圖9，只有在導入Bid 基因的重組恥垢分枝桿菌的細胞質與培養(yǎng)基中有目標蛋白的表達，且結果顯示信號肽ASP 成功將Bid 轉移至菌體外，即成功構建可分泌促凋亡蛋白Bid 的重組恥垢分枝桿菌。

圖8 Bid 重組恥垢分枝桿菌細胞質中目標蛋白表達圖

圖9 Bid 重組恥垢分枝桿菌培養(yǎng)基中目標蛋白表達圖

2.11 Annexin Ⅴ-FITC/PI 流式細胞術檢測Bid 重組恥垢分枝桿菌對小鼠巨噬細胞RAW264.7 凋亡的影響結果 在菌株刺激細胞后培養(yǎng)的12、24、48、72 h檢測細胞凋亡情況，結果顯示導入Bid 的重組恥垢分枝桿菌組較親代恥垢分枝桿菌組及含有pMV261-10His 的恥垢分枝桿菌組誘導巨噬細胞發(fā)生凋亡的比例均增大，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即Bid 重組恥垢分枝桿菌可促進細胞凋亡發(fā)生，見表2、圖10。

圖10 菌株刺激RAW264.7 細胞培養(yǎng)凋亡結果圖

圖10 菌株刺激RAW264.7 細胞培養(yǎng)凋亡結果圖（續(xù)）

表2 菌株刺激RAW264.7 細胞凋亡率（%）

3 討論

生物信息技術已被廣泛應用于醫(yī)學研究領域，本研究擬利用生物信息相關軟件初步預估小鼠促凋亡蛋白質Bid 是否可作為研究的目標蛋白，結果提示小鼠Bid 蛋白質不具有跨膜結構域與信號肽結構，屬于非分泌型蛋白質，因此可以與信號肽ASP相連接，克隆入大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質粒pMV261 中，構建分泌型重組質粒。另外，小鼠Bid 蛋白具有BH3 死亡結構域，這一點與其它文獻報道相一致。BH3 結構域可通過介導蛋白間的相互作用，誘導細胞凋亡[9]。同時本研究預測到小鼠Bid 蛋白質可與 Caspase8、Bcl2l1、Bax、Mcl -1、Bak1、Bcl2a1a、Bcl-2、Granzyme B、Caspase2、Capn2 凋亡相關蛋白發(fā)生相互作用，形成相互作用網絡。Caspase8、Caspase2 屬于半胱氨酸蛋白酶，是一類在細胞凋亡信號傳導的級聯(lián)反應中起協(xié)同作用的蛋白[10]。Bcl2l1、Mcl-1、Bcl2a1a、Bcl-2 屬于Bcl-2 蛋白家族中抑制細胞凋亡的蛋白質，Bax 屬于該家族里發(fā)揮促凋亡作用的一種蛋白質[11-13]。有研究發(fā)現(xiàn)Granzyme B通過切割Bid 或半胱氨酸蛋白酶中執(zhí)行細胞凋亡的蛋白質可調節(jié)細胞凋亡[14]。Capn2 與鈣離子有關，可通過調節(jié)線粒體所處的鈣離子環(huán)境或者誘導內質網應激等途徑對細胞凋亡產生影響[15，16]。Bid 蛋白可通過多種機制與以上凋亡調節(jié)蛋白發(fā)生相互作用，參與細胞凋亡的調控。本研究還發(fā)現(xiàn)，小鼠Bid 蛋白質與人類Bid 蛋白質具有高度相似性，故可通過小鼠Bid 蛋白的相關性質分析人類Bid 蛋白質性質。

本研究顯示，在免疫印跡實驗中，只有導入外源基因Bid 的重組恥垢分枝桿菌的細胞質與培養(yǎng)基中檢測到目標蛋白的表達，且表達結果證實信號肽成功將Bid 蛋白分泌至菌體外，即成功構建了可以分泌促凋亡蛋白Bid 的重組恥垢分枝桿菌。在流式細胞術檢測Bid 重組恥垢分枝桿菌對小鼠巨噬細胞的凋亡影響中，發(fā)現(xiàn)在檢測的4 個時間點（12、24、48、72 h），Bid 重組恥垢分枝桿菌較親代恥垢分枝桿菌及導入pMV261-10His 質粒的恥垢分枝桿菌均促進了巨噬細胞的凋亡，因此構建的Bid 重組恥垢分枝桿菌具有作為預防結核病疫苗的潛力。

下一步計劃將Bid 重組恥垢分枝桿菌注入小鼠體內，檢測其對小鼠體內巨噬細胞凋亡的影響。結核分枝桿菌是一種胞內感染菌,以細胞免疫為主。吞噬菌體的巨噬細胞凋亡，可促進周圍巨噬細胞等抗原提呈細胞的提呈抗原能力[17]。CD4+Th1 型細胞被認為在機體抗結核分枝桿菌感染中發(fā)揮關鍵作用，IFN-γ、IL-2 是其分泌的重要抗結核分枝桿菌的相關細胞因子[18，19]。CD8+T 細胞通過分泌穿孔素、顆粒酶、顆粒溶素等活性因子裂解靶細胞或者直接殺死病原菌，還能誘導吞噬菌體的靶細胞凋亡，也能分泌IFN-γ 增強巨噬細胞的抗菌能力等[20]。通過對以上相關免疫指標的檢測可進一步評估其作為結核病疫苗的價值。

綜上所述，表達外源基因Bid 的重組恥垢分枝桿菌可以促進巨噬細胞凋亡發(fā)生，這可為新型結核病預防疫苗的研發(fā)提供新的思路與技術。