周恩寧 李強(qiáng)強(qiáng) 吳黎明

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093）

1 蜂花粉營(yíng)養(yǎng)成分及其生物活性

蜂花粉是指蜜蜂從植物花藥中收集花粉，將其與少量唾腺分泌物或花蜜混合而成的不規(guī)則團(tuán)狀物[1]。研究表明，蜂花粉中含有約200 多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與活性成分，具有延緩衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抑制前列腺疾病等功效，是理想的功能性食品。其組分主要包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)、植物多酚類化合物等（如圖1 所示）。其中，蜂花粉中的碳水化合物由單糖、雙糖及多糖組分構(gòu)成，約占總干重的2/3[2]。它們?cè)谏锕δ艿恼{(diào)節(jié)中具有重要作用，具有防止肥胖、改善腸道環(huán)境、抗癌、抗腫瘤的功效。例如，堿提紅花蜂花粉多糖組分（APBPC-3）及云南產(chǎn)紅花蜂花粉多糖組分（APBPC-2）對(duì)前列腺癌細(xì)胞DU145、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231 和人肝癌細(xì)胞HepG-2 的增殖具有抑制作用[3]；蕎麥蜂花粉水溶性多糖（WFPP）對(duì)抗生素誘導(dǎo)的微生物菌群失調(diào)具有緩解作用等[4]。蜂花粉中蛋白質(zhì)的含量（一般為7.5%～35%）僅次于碳水化合物，其中包含20 多種游離氨基酸，且其必需氨基酸的含量比雞蛋、牛肉等高3～5 倍，具有很高的膳食利用價(jià)值。脂類是蜂花粉中的第三大營(yíng)養(yǎng)成分，它包含脂肪、磷脂等，其中多不飽和脂肪酸種類豐富，對(duì)于促進(jìn)大腦發(fā)育、提高記憶力以及預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化具有良好功效。植物多酚類化合物在蜂花粉中的平均含量在1.6%左右，主要包括酚酸和黃酮類化合物等[5]，它們可通過調(diào)節(jié)酶活性和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、清除自由基、螯合金屬離子以及激活轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)等發(fā)揮抗腫瘤、抗衰老、抗炎、抗糖尿病、抗癌等多種生物活性功能[6]。蜂花粉提取物中含有的酚酸類和黃酮類化合物具有清除自由基和降低血糖的潛力，并通過研究證明蜂花粉水乙醇提取物對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制作用，可減緩雙糖的分解，減少血液中的糖累積[7,8]。

圖1 蜂花粉中各成分占比及蜂花粉過敏原引發(fā)的食物過敏

2 蜂花粉致敏及脫敏研究現(xiàn)狀

盡管蜂花粉中一些過敏原會(huì)因蜜蜂加工而部分降解或減少，但這仍不能避免因食用蜂花粉或蜂花粉制劑而引發(fā)的食物過敏。而且隨著蜂花粉在食品、化妝品和保健品中的推廣，蜂花粉致敏問題不容小覷，因此與蜂花粉過敏原相關(guān)的潛在問題亟待解決。

蜂花粉引起的食物源性過敏反應(yīng)大多屬于IgE 介導(dǎo)的速發(fā)型過敏反應(yīng)?？偟膩?lái)說，當(dāng)機(jī)體初次受到過敏原刺激時(shí)會(huì)產(chǎn)生特異性抗體IgE，IgE 與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的高親和力受體（Fc?RI）結(jié)合而使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體再次暴露于相同的過敏原時(shí)，過敏原將與致敏肥大細(xì)胞/嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE 抗體特異性結(jié)合，使之脫顆粒，釋放出組胺、5-羥色胺、白三烯及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子等大量致敏介質(zhì)，作用于效應(yīng)組織和器官而引起局部或全身過敏反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)腹瀉、蕁麻疹、喉水腫、呼吸急促等異?，F(xiàn)象[9-11]。在前期研究中，分別通過發(fā)酵及酶解的方式對(duì)油菜蜂花粉蛋白進(jìn)行處理，并通過基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定出其中幾種潛在的致敏原。而且兩種處理方式的代謝組學(xué)分析顯示，經(jīng)過發(fā)酵和酶解處理后，其中潛在的致敏原含量均明顯降低，而且經(jīng)過體外免疫評(píng)估也發(fā)現(xiàn)，油菜蜂花粉蛋白與特異性IgE 的結(jié)合能力顯著下降[12,13]，這為脫敏蜂花粉產(chǎn)品開發(fā)提供了啟示。

3 植物膳食多酚的功效

膳食多酚是指植物中存在的具有多個(gè)羥基取代基或基團(tuán)的天然芳香環(huán)化合物，是具有多酚結(jié)構(gòu)的非能量次級(jí)代謝物[14]。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)，膳食多酚可以分為黃酮類化合物，如黃酮、黃酮醇、查耳酮、花色素和原花色素等，以及非黃酮類化合物，如酚酸、芪類化合物和酚酰胺等[15]。目前，植物多酚已被證明具有減輕炎癥、預(yù)防糖尿病、下調(diào)促炎細(xì)胞因子等免疫調(diào)節(jié)作用[16]。如綠茶多酚可以降低高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖犬的體重增加，改善其腸道微生物群的變化并減輕腸道炎癥[17]；芒果多酚、石榴多酚可以下調(diào)促炎細(xì)胞因子，改善炎癥性腸病[18]；槲皮素能夠抑制胰腺鐵沉積，改善II 型糖尿病[19]；以及丁烯酸、小構(gòu)樹多酚能夠預(yù)防細(xì)胞因子誘導(dǎo)的胰島B 細(xì)胞損傷和減少/延遲I 型糖尿病中胰島B 細(xì)胞損傷的程度等[20,21]。

膳食多酚在抗過敏方面也具有良好功效。有研究表明，多酚可以通過抑制過敏小鼠外周B 細(xì)胞的粘附和遷移、抑制IgE 和IgG1 水平以及消除Th2 型細(xì)胞因子來(lái)減輕過敏反應(yīng)[22]。黃酮類化合物可以通過抑制MHC-II 和共刺激分子（CD80、CD86）的細(xì)胞表面表達(dá)，導(dǎo)致抗原呈遞無(wú)效或抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生，直接影響樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞[23]。酚類化合物，如咖啡酸和阿魏酸，已被證明可降低花生提取物和液體花生醬的過敏性，與過敏蛋白形成不溶性復(fù)合物[24]。因此，膳食多酚在脫敏/降敏方面的應(yīng)用值得進(jìn)一步研究。

4 植物多酚共價(jià)修飾致敏蛋白的研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)與膳食多酚可通過非共價(jià)鍵如范德華力、氫鍵以及疏水相互作用等實(shí)現(xiàn)兩者的非共價(jià)結(jié)合，但這樣形成的復(fù)合物容易受外界因素的影響發(fā)生解離[25]；而蛋白質(zhì)與植物多酚的共價(jià)結(jié)合可以形成強(qiáng)而穩(wěn)定的共價(jià)復(fù)合物，據(jù)研究報(bào)道，酶法、堿處理法與自由基誘導(dǎo)法均可以制備出穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-多酚共價(jià)復(fù)合物。其中，酶法是指在條件溫和的環(huán)境下使用漆酶和辣根氧化酶等酶催化誘導(dǎo)蛋白質(zhì)與多酚間的共價(jià)反應(yīng)，具有安全性、廣適性的優(yōu)點(diǎn)；自由基誘導(dǎo)法是指過氧化氫（H2O2）與抗壞血酸發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成羥基自由基，羥基自由基再氧化蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的氨基酸，最終多酚與氧化的蛋白共價(jià)結(jié)合[26,27]；堿處理法是指多酚可以在堿性（pH=9）有氧條件下氧化為醌，而醌是一種反應(yīng)性親電中間體，通過與蛋白質(zhì)側(cè)鏈的巰基或氨基親核加成形成強(qiáng)而穩(wěn)定的C-S 或C-N 鍵形成共價(jià)鍵[27]。

研究表明，膳食多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合可以改變蛋白質(zhì)起泡性、凝膠性、乳化性、溶解度等功能性質(zhì)[28]；而且，蛋白質(zhì)-多酚相互作用能使蛋白具有較強(qiáng)的抗氧化能力和多種生物活性，例如抗?jié)?、抗癌及預(yù)防心血管疾病等。除此之外，膳食多酚與致敏蛋白共價(jià)結(jié)合還可以降低食物致敏蛋白的致敏性，改善食物過敏反應(yīng)。而且近年來(lái)有許多學(xué)者研究了膳食多酚和致敏蛋白共價(jià)結(jié)合，以減少/消除食物過敏原的致敏性。據(jù)報(bào)道，綠原酸（CA）和木犀草素共價(jià)修飾小麥過敏原Gliadin，使其IgE 結(jié)合能力下降，并顯著提升其熱穩(wěn)定性、抗氧化活性及體外消化率[29]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和CA 共價(jià)修飾β-乳球蛋白（β-LG），可以改變?chǔ)?LG 的空間結(jié)構(gòu)，有效降低β-LG 與IgE 的結(jié)合能力[30]。同樣，EGCG 和CA 共價(jià)修飾花生變應(yīng)原Ara h1 降低了其變性溫度和IgE 結(jié)合能力，并使嗜堿性細(xì)胞的組胺釋放顯著減少。而且，經(jīng)體外消化實(shí)驗(yàn)證明，與膳食多酚共價(jià)結(jié)合后Ara h 1 的消化率明顯提高[31]。此外，EGCG 對(duì)卵清蛋白（OVA）的共價(jià)結(jié)合提高了OVA 的消化率和抗氧化能力，并降低了OVA 的IgE 結(jié)合能力。除了EGCG 和CA，槲皮素也被用于與致敏蛋白共價(jià)結(jié)合。而且，槲皮素對(duì)OVA 的共價(jià)修飾可以改變OVA 的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，破壞或掩蓋OVA 的抗原表位，降低其IgE 結(jié)合能力，并顯著降低小鼠脾臟中Th2 型細(xì)胞因子IL-13、IL-4和IL-5 以及略微升高Th1 型細(xì)胞因子IFN-γ，調(diào)節(jié)Th1/Th2 免疫反應(yīng)的不平衡，緩解小鼠由OVA 引起的過敏反應(yīng)[32]。

因此，植物多酚共價(jià)結(jié)合致敏蛋白的潛在降敏機(jī)制可以由圖2、圖3 解釋，即：結(jié)合致敏蛋白過敏原與膳食多酚結(jié)合可以增強(qiáng)蛋白聚集，改變致敏蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，從而改變其變應(yīng)原性，使致敏蛋白的IgE結(jié)合能力降低，并抑制Th 細(xì)胞分泌致敏細(xì)胞因子，抑制肥大細(xì)胞釋放過敏介質(zhì)[25,33]。說明膳食多酚共價(jià)修飾食物致敏蛋白是一種有效的食物降敏或脫敏方式，具有廣泛的應(yīng)用前景。

圖2 植物多酚共價(jià)修飾過敏原導(dǎo)致過敏原構(gòu)象改變

圖3 植物多酚共價(jià)修飾降低過敏原變應(yīng)原性的潛在機(jī)理

5 食物致敏蛋白的免疫原性評(píng)價(jià)

5.1 體外檢測(cè)

5.1.1 免疫學(xué)方法

酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）能夠利用連接到抗體上的酶來(lái)檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物，并通過顏色變化來(lái)指示抗原-抗體復(fù)合物的存在，通常用于血清中的抗體和食品中的致敏原的定性或定量檢測(cè)。但它不能檢測(cè)受損或未折疊的致敏蛋白，因此，ELISA可以用于評(píng)估經(jīng)過某種加工手段處理后的食品中致敏原構(gòu)象表位是被暴露還是掩蓋或破壞，從而檢驗(yàn)食品加工技術(shù)對(duì)食品中致敏原破壞的有效性[34]。蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)）即Western Blot 可以將電泳分離后的致敏蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到固相載體上，然后用特異性抗體對(duì)致敏蛋白進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于抗體活性檢測(cè)和疾病早期診斷等多個(gè)方面[35]。斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)（Dot Blot）是一種利用固相載體，進(jìn)行抗原、抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法，相比于Western Blot 可以快速、微量的對(duì)食物中的致敏原進(jìn)行評(píng)估[36]。

5.1.2 聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

當(dāng)致敏原含量很低無(wú)法通過免疫學(xué)方法進(jìn)行分析時(shí)，可以通過PCR 來(lái)檢測(cè)致敏原的基因含量從而對(duì)致敏原進(jìn)行評(píng)估，因?yàn)榛赑CR 的方法對(duì)致敏原進(jìn)行評(píng)估是對(duì)致敏原的DNA 進(jìn)行檢測(cè)而不是致敏蛋白[37]。而且食品加工可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集而使抗原表位被掩蓋或破壞蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象使致敏蛋白不能夠被常規(guī)檢測(cè)方法指示，但DNA 卻能夠在加工過程中更穩(wěn)定[38]。因此，PCR 比基于抗體的檢測(cè)方法更有效、靈敏度更高。

5.1.3 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用可以對(duì)致敏蛋白進(jìn)行鑒定和表征，它具有高靈敏性、高分辨率、高自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，并且可以評(píng)估經(jīng)過加工處理后的食品致敏蛋白、亞型、特異性肽段等，并且在檢測(cè)復(fù)雜樣品中的多個(gè)過敏原蛋白時(shí)具有優(yōu)越性，不依賴于免疫學(xué)方法中抗原與抗體的相互作用[39]。

5.1.4 基于生物傳感器對(duì)食物過敏原檢測(cè)的方法

生物傳感器可以將固定化的生物活性材料作為識(shí)別元件，通過換能器將生化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成可定量的物理或化學(xué)信號(hào)，在食品工業(yè)中可以用于食品病原體、食品添加劑及食品致敏原等的檢測(cè)[40,41]。生物傳感器具有靈敏度高、微型化等優(yōu)點(diǎn)，近年已有多種用于檢測(cè)食品中致敏原的生物傳感器被開發(fā)并成為食品過敏原檢測(cè)的高新技術(shù)。

5.2 體內(nèi)檢測(cè)

5.2.1 臨床人體試驗(yàn)

目前臨床常用的過敏原檢測(cè)方法有：皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)（SPT）、特應(yīng)性斑貼試驗(yàn)（APT）、皮內(nèi)試驗(yàn)、血液試驗(yàn)等。SPT 指的是將過敏原引入皮下，檢測(cè)與皮下肥大細(xì)胞結(jié)合的特異性IgE 抗體的產(chǎn)生。SPT 敏感性高，假陽(yáng)性低，重現(xiàn)性好，對(duì)患者的不適最小，結(jié)果在15min 內(nèi)得出。APT 是指將帶過敏原的貼片貼在試驗(yàn)部位，48～72h 后檢查反應(yīng)。皮內(nèi)試驗(yàn)是指皮內(nèi)注射過敏原，它比SPT 更敏感，但假陽(yáng)性率較高，對(duì)患者的風(fēng)險(xiǎn)較高[42]。血檢通過檢測(cè)血液中的抗體來(lái)檢測(cè)過敏原，主要用于懷疑食物過敏，血液測(cè)試比皮膚測(cè)試更安全、更準(zhǔn)確，但比皮膚測(cè)試更昂貴、更耗時(shí)[43]。

5.2.2 基于動(dòng)物模型評(píng)估食物過敏原的免疫原性

食物過敏的動(dòng)物模型是對(duì)過敏原研究更安全高效的方法。目前已知的動(dòng)物模型有嚙齒類動(dòng)物模型：小鼠、大鼠及豚鼠模型；非嚙齒類動(dòng)物模型：豬、狗模型。與人類相比，豬、狗模型具有與人類相似的免疫系統(tǒng)，但是它們操作難度大，需要大量的蛋白質(zhì)給藥，敏化需要較長(zhǎng)的給藥時(shí)間，維護(hù)成本高，而且缺乏相應(yīng)的免疫試劑，因此限制性比較大[44]。而嚙齒類動(dòng)物由于體積較小，繁殖周期短，因此對(duì)食物過敏進(jìn)行評(píng)估時(shí)應(yīng)用比較廣泛。目前，用于評(píng)估食物過敏原的嚙齒動(dòng)物中，以小鼠品系應(yīng)用最多，如BALB/c、C3H/HeJ、A/J、C57BL/6 及KM 小鼠等，大鼠品系有BN、SD、Wistar 等以及Hartly 豚鼠模型。它們主要作為食物過敏、皮膚過敏、過敏性哮喘等模型應(yīng)用于食物過敏原的評(píng)估。

一般來(lái)說，食物過敏會(huì)使體內(nèi)Th1/Th2 免疫反應(yīng)失衡，使免疫反應(yīng)向Th2 方向發(fā)展，此時(shí)，Th1 型細(xì)胞因子低于正常水平，而Th2 型細(xì)胞因子高于正常值。IL-2 和干擾素γ（IFN-γ）是Th1 型細(xì)胞產(chǎn)生的主要細(xì)胞因子，IL-2 可以刺激Th1 細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，IFN-γ 可以阻止抗體種類向IgE 的轉(zhuǎn)化并抑制Th2免疫應(yīng)答。IL-4、IL-5、IL-13 是Th 2 型細(xì)胞產(chǎn)生的主要細(xì)胞因子，它們可以促進(jìn)IgE 的轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)IgG同種型轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG1 并刺激肥大細(xì)胞增殖，從而誘發(fā)機(jī)體全身過敏反應(yīng)[45]。Th17 細(xì)胞可以促進(jìn)IgE 產(chǎn)生，并且IL-17A 能夠直接在B 細(xì)胞水平上發(fā)揮其促過敏作用[46]。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）是影響過敏反應(yīng)的另一關(guān)鍵因素，它可以分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10 和/或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β），從而抑制效應(yīng)Th1、Th2 和Th17 細(xì)胞，抑制肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，并消除過敏原特異性IgE 的產(chǎn)生[47]。肥大細(xì)胞蛋白酶-1（mMCP-1）是檢測(cè)肥大細(xì)胞脫顆粒的關(guān)鍵指標(biāo)，而且血清中的IgG、IgG1 水平與Th2 免疫水平呈正相關(guān)，故在對(duì)過敏原評(píng)估時(shí)對(duì)血清中IgG、IgG1、mMCP-1 的檢測(cè)同樣重要。

例如，Zhang 等人以卵清蛋白、卵清蛋白-槲皮素共價(jià)復(fù)合物分別配合霍亂毒素為佐劑口飼BALB/c 小鼠，他們發(fā)現(xiàn)復(fù)合物能夠降低小鼠血清中IgE、IgG1、IgG、血漿組胺和mMCP-1 的水平，并顯著降低小鼠脾臟中Th2 型細(xì)胞因子IL-13、IL-4 和IL-5以及略微升高Th1 型細(xì)胞因子IFN-γ，這表明復(fù)合物可以調(diào)節(jié)Th1/Th2 免疫反應(yīng)的不平衡，緩解小鼠由卵清蛋白引起的過敏反應(yīng)[32]。Yang 等人對(duì)BALB/c 小鼠管飼乳酸菌處理的大豆蛋白，他們發(fā)現(xiàn)與管飼未經(jīng)過處理的大豆蛋白的小鼠相比，IFN-γ 和IL-2 和IL-10 細(xì)胞因子的分泌增加，IL-4 和IL-6 和IL-17A細(xì)胞因子的分泌減少，證明乳酸菌可以調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，維持小鼠免疫相關(guān)細(xì)胞和細(xì)胞因子的正常水平[45]。

6 總結(jié)與展望

綜上所述，蜂花粉營(yíng)養(yǎng)豐富，具有極高的保健價(jià)值及開發(fā)潛力。然而，蜂花粉中過敏原的存在為蜂花粉的食用安全帶來(lái)威脅，制約行業(yè)發(fā)展。有效改善蜂花粉的致敏問題對(duì)進(jìn)一步開發(fā)相關(guān)蜂花粉產(chǎn)品及提高其食用安全性至關(guān)重要。到目前為止，關(guān)于蜂花粉的致敏及脫敏/降敏機(jī)制的研究報(bào)道較少。運(yùn)用合適的食品加工方式及免疫評(píng)估手段對(duì)蜂花粉致敏及脫敏/降敏機(jī)理進(jìn)行深入研究對(duì)于促進(jìn)行業(yè)發(fā)展是十分必要的。通過本綜述，可進(jìn)一步明確植物多酚共價(jià)修飾技術(shù)在改善蜂花粉致敏性中的應(yīng)用前景，為后續(xù)蜂花粉脫敏/低敏產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。