李櫻紅 周 萍 李加芬 吳曉群 郇敏 李珊珊 胡福良

（1 浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院 NMPA微生物檢測與預(yù)警重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省藥品接觸材料質(zhì)量控制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310052；2 杭州碧于天保健品有限公司，桐廬 311500；3 安徽蜜之源食品集團(tuán)有限公司，蕪湖 241000；4 桐廬縣市場監(jiān)管局，桐廬 3 115005；5 桐廬縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，桐廬 311500；6 浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058）

1 引言

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1]。蜂蜜在生產(chǎn)過程中，由于追求產(chǎn)量和操作不規(guī)范等因素，導(dǎo)致市場上會(huì)有一些非成熟蜜的出現(xiàn)。非成熟蜂蜜的特點(diǎn)是水分含量較高，約24%～36%，如果保存和生產(chǎn)方式不當(dāng)，這種蜂蜜極易發(fā)酵，從而影響蜂蜜品質(zhì)[2]。而成熟蜂蜜則是蜜蜂采集花蜜后在蜂房內(nèi)自然釀造而成，水分含量在15%～20%之間，成熟蜂蜜貯存在蜂房中，蜜蜂在其上方泌蠟封蓋，其質(zhì)量穩(wěn)定，不易發(fā)酵，市場上常見的巢蜜是成熟蜂蜜的一種商品形式[3]。當(dāng)蜂蜜被微生物特別是嗜滲酵母等污染時(shí)，在高糖環(huán)境脅迫下，會(huì)分泌出甘油[4]。劉功良等[5]從蜂蜜中獲得1 株可耐受700g/L 葡萄糖濃度的蜂蜜接合酵母LGL-1，這種酵母在高糖培養(yǎng)基中72h 后，甘油含量可達(dá)2.6g/L。Huidobro 等研究表明，在甘油含量超過200mg/kg 時(shí)，超過79%的蜂蜜中含有微生物和孢子[6]。由于非成熟蜜極易受微生物污染發(fā)酵，檢測表明，其中的甘油含量明顯高于成熟蜂蜜[4]?？梢姡视蜌埩袅靠勺鳛榉涿畚⑸镂廴緯r(shí)的標(biāo)志性成分之一。

德國《食品化工》雜志在1998 年報(bào)道了我國蜂蜜含有大量的酵母菌和甘油，水分在20%～28%之間，8 種蜂蜜的甘油含量在500 mg/kg 以上[7]。自此甘油含量成為出口蜂蜜的必檢指標(biāo)?，F(xiàn)行蜂蜜食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《蜂蜜》（GB 14963-2011）[1]中規(guī)定糖類和微生物等指標(biāo)，受到微生物污染的蜂蜜可通過滅菌、濃縮等手段達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。我國蜂蜜的行標(biāo)《蜂蜜》（GH/T 18796-2012）[8]和國際食品法典委員會(huì)的蜂蜜標(biāo)準(zhǔn)《蜂蜜》（CXS 12-1981，2019 版）[9]，規(guī)定淀粉酶值和羥甲基糠醛指標(biāo)，用來反映蜂蜜新鮮度，而成熟蜂蜜與非成熟蜂蜜均能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。但是，蜂蜜因微生物污染而形成的甘油極難從蜂蜜中去除，甘油含量的高低可以真實(shí)反映蜂蜜曾受微生物污染的程度，是衡量蜂蜜品質(zhì)的極為關(guān)鍵指標(biāo)，也可以作為判定蜂蜜是否成熟的重要指標(biāo)。

本文就蜂蜜中的甘油殘留量進(jìn)行測定，比較蜂蜜原料、不同加工方式的蜂蜜半成品和成品，以及市售商品化蜂蜜中甘油殘留量，同時(shí)檢測果葡糖漿中甘油殘留量，根據(jù)蜂蜜及果葡糖漿中甘油殘留量，提出蜂蜜中殘留量限度標(biāo)準(zhǔn)的建議，進(jìn)而為蜂蜜的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

Shimadzu LC-10A 型高效液相色譜儀（包括在線脫氣機(jī)、二元泵、手動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、示差折光檢測器）；Sartorius BS224S 分析天平；甘油（純度大于99%，中國食品藥品檢定研究院）；醫(yī)藥級微粉硅膠（純度大于99%）；赤蘚糖醇內(nèi)標(biāo)（純度大于99%）；95%乙醇為分析純；乙腈為HPLC 級；蒸餾水（符合GB/T 6682 一級水）。

蜂蜜原料、半成品及成品由安徽蜜之源食品集團(tuán)有限公司提供，24 個(gè)商品化蜂蜜為市場采購，涉及11 家生產(chǎn)企業(yè)。詳情見表1。

表1 市場采購商品化蜂蜜信息表

2.2 高效液相色譜法檢測甘油含量

蜂蜜樣品中的甘油含量檢測參照《蜂蜜中甘油含量測定——高效液相色譜法》（GH/T 1313-2020）[10]。

2.2.1 樣品處理

稱取蜂蜜樣品5.0 g，精確至0.05g，于90mm蒸發(fā)皿中，分別加入100mg/mL 赤蘚糖醇內(nèi)標(biāo)溶液200μL，水1mL，乙醇5mL，攪拌均勻至完全溶解，加入2.5g 微粉硅膠，攪拌充分分散，150℃電熱板上緩緩邊攪拌邊蒸干，轉(zhuǎn)入50 mL 玻璃離心瓶中，加入20mL 乙腈，混勻，超聲20min，每隔5min 取出搖勻，4000rpm 離心3min，吸取上清液于50mL 茄形瓶中，殘?jiān)性偌尤?0mL 乙腈重復(fù)提取1 次，合并上清液，70℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加1mL 乙腈水溶液（9+1），超聲溶解殘?jiān)?，吸取溶解后的樣液?jīng)0.22μm 濾膜過濾，得試樣溶液。

2.2.2 空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

稱取5 份空白樣品各5.0g，精確至0.05g，于90mm 蒸發(fā)皿中，各加入100mg/mL 赤蘚糖醇內(nèi)標(biāo)溶液200μL，各加入2mg/mL 甘油工作標(biāo)準(zhǔn)液Ⅱ125μL、250μL、500μL，和20mg/mL 甘油工作標(biāo)準(zhǔn)液Ⅰ 125μL、250μL，從2.2.1“水1mL”起依此操作，得到空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度為250mg/L、500mg/ L、1000mg/L、2500mg/L、5000mg/L。

2.2.3 液相條件

色譜柱：聚合物氨基填料色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；或等效色譜柱；流動(dòng)相：乙腈+水=87+13；流動(dòng)相流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；檢測池溫度：35℃；進(jìn)樣量：40μL。

2.2.4 測定

用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液（2.2.2）、試樣溶液（2.2.1）分別進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，以甘油與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對樣品進(jìn)行定量。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及試樣溶液中甘油與人標(biāo)的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Microsoft Excel 2010 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按GH/T 1313-2020 的要求，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性方程：y=0.000810x+0.00768，相關(guān)系數(shù)r2=0.9995?？瞻讟悠芳瓣栃詷悠飞V圖見圖1。如圖1 所示，甘油和內(nèi)標(biāo)色譜峰分離度良好，甘油的參考保留時(shí)間為6.5 min，內(nèi)標(biāo)的參考保留時(shí)間為9.2 min。

圖1 蜂蜜空白樣品及陽性樣品色譜圖

3.2 蜂蜜原料中甘油殘留量分析

花蜜被蜜蜂采回并貯存在蜂房中，由于蜂房環(huán)境相對潔凈，蜂蜜中含有抗菌成分，水分不斷蒸發(fā)，則蜂房中的蜂蜜不宜發(fā)酵。當(dāng)蜂蜜被蜂農(nóng)采收，蜂蜜被置于較差的衛(wèi)生環(huán)境中，受到水、空氣、包裝桶等的污染，在常溫條件下，蜂蜜產(chǎn)生發(fā)酵現(xiàn)象。作為發(fā)酵產(chǎn)物的乙醇、甘油、二氧化碳，在蜂蜜加工的真空濃縮工序中，除甘油以外均可被蒸發(fā)去除，因此，用甘油來指證蜂蜜的發(fā)酵事實(shí)是一種行之有效的方法[4]。通過對常見的油菜蜂蜜、洋槐蜂蜜、椴樹蜂蜜、荊條蜂蜜、棗花蜂蜜、荔枝蜂蜜等原料以及封蓋的成熟蜜（巢蜜）進(jìn)行甘油殘留量分析，結(jié)果見表2。

表2 蜂蜜原料中甘油含量

從表2 可知，蜂蜜原料樣品中的水分含量范圍為16.3%～29.2%，蜂蜜原料均檢出了甘油，含量范圍為28.2～478mg/kg。研究發(fā)現(xiàn)蜂蜜原料的水分含量在18%以下時(shí)，相應(yīng)的甘油殘留量在50 mg/kg 以下。水分含量在18%～23%時(shí)，甘油含量在28～100mg/kg 之間。當(dāng)水分含量超過23%時(shí)，甘油含量在103～478mg/kg之間。表明蜂蜜原料中水分含量越高，甘油含量也越高。這與前人研究結(jié)果[11,12]一致：蜂蜜含水量在17.1%～18%時(shí)，每克含1000 個(gè)以下菌體的蜂蜜，一般條件下貯存1 年之內(nèi)不會(huì)發(fā)酵，蜂蜜水分超過20%時(shí)，發(fā)酵很容易發(fā)生。這同樣說明了蜂蜜采收時(shí)，應(yīng)充分保證衛(wèi)生規(guī)范的重要性。

3.3 蜂蜜半成品中甘油殘留量分析

對常見的油菜蜂蜜、洋槐蜂蜜、椴樹蜂蜜、荊條蜂蜜、棗花蜂蜜、荔枝蜂蜜等蜂蜜半成品進(jìn)行甘油含量的分析，結(jié)果見表3。

從表3 可知，蜂蜜原料貯存近1 個(gè)月后，濃縮加工成的半成品蜂蜜中，水分含量范圍為18.2%～19.3%，而甘油含量明顯升高，最高達(dá)到895mg/kg。值得注意的是，有2 批來自我國西北的洋槐蜂蜜的甘油含量提升不明顯（收購日期20210505和20210512），仍然在100mg/kg 以下，可能是由于西北地區(qū)干燥多風(fēng)，洋槐蜂蜜容易脫水，且環(huán)境微生物污染程度低，不易產(chǎn)生發(fā)酵。蜂蜜原料到工廠后，等待抽樣檢測的時(shí)間較長，等到全部檢測結(jié)果出來做出品質(zhì)判定時(shí)，至少需要半個(gè)月的時(shí)間，加上時(shí)值春季，氣溫升高，微生物很易繁殖。李亮等報(bào)道[13]，蜂蜜在室溫下貯存第4 周時(shí)，蜂蜜中甘油含量明顯增加，從649mg/kg 增加到1101mg/kg。因此，為了保證產(chǎn)品質(zhì)量，到工廠的蜂蜜應(yīng)該盡快進(jìn)行濃縮。建議工廠可對高風(fēng)險(xiǎn)且關(guān)鍵的質(zhì)量安全項(xiàng)目進(jìn)行檢測，符合要求即可進(jìn)行濃縮。

表3 蜂蜜半成品中甘油含量

3.4 蜂蜜成品中甘油殘留量分析

對3.3 的半成品蜂蜜進(jìn)行成品加工，取樣分析甘油殘留量，結(jié)果見表4。

從表4 可知，經(jīng)過濃縮后，蜂蜜的水分范圍降到16.3%～19.5%，甘油含量范圍為 30.8～890mg/kg。表明蜂蜜處于品質(zhì)穩(wěn)定的狀態(tài)，不容易產(chǎn)生發(fā)酵現(xiàn)象，其甘油含量變化幅度不大，達(dá)到相對穩(wěn)定的狀態(tài)。

表4 蜂蜜成品中甘油含量

3.5 商品蜂蜜中甘油殘留量分析

從原料、半成品、成品的檢測情況看，甘油含量在水分低于19.5%以下時(shí)穩(wěn)定，當(dāng)水分高于24%時(shí)，蜂蜜處于發(fā)酵活躍狀態(tài)，甘油含量處于快速增加期。在生產(chǎn)過程中，工廠對蜂蜜進(jìn)行了滅菌處理，水分也降到19.5%以下的水平，此時(shí)，蜂蜜中甘油含量變化率在-9.43%～8.81%之間，處于相對穩(wěn)定期。

對市售的24 個(gè)商品化蜂蜜進(jìn)行甘油檢測，結(jié)果見表5。

表5 商品蜂蜜中甘油含量

從表5 可知，市售商品化蜂蜜均檢測出甘油殘留。4 個(gè)蜂蜜樣品甘油殘留量小于100mg/kg，3 個(gè)蜂蜜樣品甘油殘留量為100～199mg/kg，6 個(gè)蜂蜜樣品甘油殘留量為200～399mg/kg，2 個(gè)蜂蜜樣品甘油殘留量為400～800mg/kg，3 個(gè)蜂蜜樣品甘油殘留量為800～999mg/kg，6 個(gè)蜂蜜樣品甘油殘留量大于1000mg/kg，占比25%。甘油含量小于400mg/kg 的蜂蜜占比54.2%，表明由于我國蜂蜜國家或者行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)未規(guī)定甘油出限量質(zhì)量指標(biāo)，生產(chǎn)企業(yè)未對蜂蜜中甘油含量進(jìn)行監(jiān)控，原料未及時(shí)采取冷藏或者及時(shí)加工等防止微生物發(fā)酵的措施，導(dǎo)致市場上不同品牌不同花種蜂蜜中甘油含量差異較大的現(xiàn)象發(fā)生。

3.6 蜂蜜中甘油含量的限量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀分析

甘油被認(rèn)為是區(qū)別成熟與非成熟蜂蜜的主要指標(biāo)，常常出現(xiàn)在出口蜂蜜的質(zhì)量指標(biāo)中。一些國內(nèi)企業(yè)對蜂蜜中甘油的限量做出了規(guī)定，我國現(xiàn)行蜂蜜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如下表6，作為蜂蜜發(fā)酵程度及蜂蜜成熟度的指標(biāo)，甘油是蜂蜜質(zhì)量指標(biāo)的關(guān)鍵項(xiàng)目。某企業(yè)對甘油限量給出小于100mg/kg 的要求，從我們抽查的商品蜂蜜情況看，只占到總數(shù)的17%，按團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)300mg/kg 的限量要求，只占到總數(shù)的29.2%。我國市場上蜂蜜中甘油的含量處于一個(gè)較高水平，大部分不能達(dá)到團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)特等品的要求。消費(fèi)者報(bào)道欄目對市場上的8 款蜂蜜進(jìn)行了甘油含量檢測[14]，僅1 款小于300mg/kg，500mg/kg 以下的有4 款，占50%。甘油含量大于1000mg/kg 的有2 款蜂蜜，或已變酸。

表6 現(xiàn)行不同蜂蜜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量指標(biāo)比較

3.7 蜂蜜中甘油含量的限度標(biāo)準(zhǔn)建議

蜂蜜中的甘油含量與酵母菌發(fā)酵直接相關(guān)，發(fā)酵程度又與蜂蜜污染微生物的程度以及含水量有關(guān)。從原料情況看，蜂蜜送到工廠時(shí)，就可能有甘油的存在，當(dāng)蜂蜜中水分低于24%時(shí)，甘油含量處于一個(gè)較低水平，蜂蜜含水量在20%以下時(shí)，蜂蜜中的甘油含量處于穩(wěn)定。

本文檢測了24 個(gè)商品化蜂蜜樣品，結(jié)果300mg/kg以下占比29.2%，500mg/kg 以下占比54.2%。前期研究報(bào)道表明，316 個(gè)蜂蜜樣品中，300mg/kg 以下占比67%，500mg/kg 以下占比87%[6]。在8 個(gè)蜂蜜樣品中，300mg/kg 以下占比12.5%，500mg/kg 以下占比50%[13]。

綜合上述情況，建議甘油殘留量300mg/kg 以下的蜂蜜為特等品，甘油殘留量在300～500mg/kg 的蜂蜜為合格品（按蜂蜜團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的分級方法）。成熟蜂蜜甘油含量應(yīng)控制在200mg/kg 以下。

4 結(jié)論

通過前期研究，起草發(fā)布了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《蜂蜜中甘油含量測定——高效液相色譜法》（GH/T 1313-2020）[10]，將甘油列為蜂蜜品質(zhì)指標(biāo)，可以監(jiān)控蜂蜜的微生物污染狀況，促使蜂農(nóng)生產(chǎn)成熟蜂蜜，提升蜂農(nóng)采收蜂蜜的衛(wèi)生意識，從而提升我國蜂蜜的整體質(zhì)量水平[15]。本研究進(jìn)一步檢測了原料、半成品、成品蜂蜜、商品化蜂蜜中的甘油殘留量，查閱了相關(guān)文獻(xiàn)，建議甘油含量300mg/kg 以下的蜂蜜為特等品，甘油含量在300～500mg/kg 的蜂蜜為合格品（按蜂蜜團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的分級方法）。成熟蜂蜜甘油含量應(yīng)控制在200mg/kg 以下。根據(jù)蜂蜜中甘油形成的原理，建議蜂農(nóng)在取蜜時(shí)，應(yīng)注意衛(wèi)生，防止微生物的污染，提倡生產(chǎn)成熟蜂蜜。蜂蜜原料到工廠后，應(yīng)將蜂蜜置于陰涼、通風(fēng)、干燥處，并盡快將蜂蜜濃縮至水分20% 以下。蜂蜜加工應(yīng)注意控制微生物指標(biāo)，對于微生物超過國家標(biāo)準(zhǔn)的蜂蜜，應(yīng)做好滅菌工作。