汪姣，包良，杜吉雅，張菱芳，王海生

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059）

肝癌是常見的惡性腫瘤，是發(fā)病率和病死率最高的5種癌癥之一［1］。肝癌治療方法多樣，目前臨床以手術(shù)治療、化療、放療和靶向治療等療法為主［2］。因肝癌早期癥狀不明顯，患者就診時多為中晚期，不再適合手術(shù)治療，晚期肝癌患者的治療方法有限，且復發(fā)率高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移。中醫(yī)藥療法在治療肝癌的過程中有預防復發(fā)、轉(zhuǎn)移等優(yōu)點［3］。

斑蝥素（cantharidin）是傳統(tǒng)中藥斑蝥的有效提取成分，研究表明其對胃癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌等多種腫瘤細胞具有較強的抑制作用［4］。斑蝥素可通過阻滯肝癌細胞周期使其停滯在G2/M 期，有效抑制其增殖，并促進凋亡，從而發(fā)揮抗癌效應［5］；還可通過下調(diào)P－糖蛋白表達情況，逆轉(zhuǎn)肝癌HepG2/ADM 的多藥耐藥性［6］。目前，針對斑蝥素治療肝癌的機制進行了大量研究，但主要以單靶點、單通路的作用機制為主，對其潛在的機制尚未進行系統(tǒng)的研究。因此，筆者運用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術(shù)進一步對斑蝥素治療肝癌的作用機制進行系統(tǒng)分析，以期為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

人肝癌細胞株HepG2 細胞為本實驗室凍存，在37 ℃、5%CO2的細胞箱中培養(yǎng)。

1.1.2 試驗藥物、主要試劑及儀器

斑蝥素（美國Sigma公司，25 mg/瓶，批號：C7632），溶于DMSO 溶液中，配制成50 mmol/L 的母液，在?20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco 公司，批號：8121174、2117119）；CCK－8（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：MA0218－5－May－15E）；RIPA 裂解液（上海尚寶生物科技有限公司，批號：1092891）；二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶有限公司，批號：67－68－5）；RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒（日本Takara 生物公司，批號：PK0542、AKG0730A、AKE1154A）；Akt、PT3K（美國Affinity 公司，批號：AF6214、AF6261）；ECL 顯色液（美國伯樂公司，批號：102031721）；BCA 蛋白定量試劑盒（美國Thermo 公司，批號：VL316399）；Matrigel 膠（上海碧云天有限公司，批號：120420210222）。

多功能酶標儀（美國thermo公司）；PCR 儀（美國羅氏公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國伯樂公司）。

1.2 方法

1.2.1 斑蝥素靶點的篩選

通過PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫獲取斑蝥素的2D 結(jié)構(gòu)和SMILES 表達式，運用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：//old.tcmsp－e.com/tcmsp.php）和SwissTargetPrediction（https：//www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫，將Organism 設置為Homo Sapiens（人類），入選預測概率選擇大于0，將兩個數(shù)據(jù)庫中獲得的靶點合并去重，得到斑蝥素的預測靶點。

1.2.2 肝癌靶點的獲取

以“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞進行檢索，在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）和TTD 數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）中獲取肝癌的潛在靶點。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，Score值越高則代表該靶點與疾病聯(lián)系越密切，因此，以Score值為條件，將Score值大于中位數(shù)的靶點選擇為肝癌的潛在靶點。合并兩個數(shù)據(jù)庫中獲得的交集靶點，刪除重復，得到疾病相關(guān)的靶點。利 用Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）對藥物作用靶點和疾病靶點取交集，得到“斑蝥素－肝癌”共同靶點31個。

1.2.3 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建及核心蛋白的篩選

運用STRING 數(shù)據(jù)庫，輸入31個共同靶基因，將物種設置為Homo Sapiens，選擇交互作用大于0.4，去除游離節(jié)點，下載“tsv”格式的數(shù)據(jù)，將其導入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡。將同時滿足Degree、Betweenness 和Closeness 三項數(shù)據(jù)，并在平均值之上的靶基因選為核心靶點。

1.2.4 GO功能富集和KEGG通路富集分析

基于DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.abcc.ncifcrf.gov/）進行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。將得到的交集靶點基因上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫，并以P<0.05為篩選條件，將結(jié)果繪制成氣泡圖。

1.2.5 分子對接

從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載斑蝥素mol2結(jié)構(gòu)，從蛋白數(shù)據(jù)PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）中選擇下載核心靶點度值前6 的蛋白質(zhì)3D 結(jié)構(gòu)的pdb 格式文件，并要求所選擇的蛋白盡量滿足以下條件［7］：①選擇物種為人；②蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中必須有1 個或多個小分子配體；③分辨率高；④pH 值接近人體正常生理范圍。利用AutoDock 4.2.6 軟件進行分子對接，并通過Pymol 2.4.0軟件將對接結(jié)果可視化。

1.2.6 CCK檢測HepG2增殖

HepG2細胞以濃度1×105/mL均勻接種至96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL。待細胞貼壁后分別加入終濃度為0、2.5、5、10、20 μmol/L的斑蝥素，培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK－8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標儀測定450 nm波長的光密度值（optical density，OD）。

1.2.7 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real－time PCR）檢測mRNA的水平

按照Trizol 試劑（Invitrogen）說明書提取實驗組和對照組的細胞內(nèi)總RNA，采用Nanodrop ND－1000 測定RNA 的濃度和純度，使用cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）對1 μg 的RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄，再以cDNA 為模板，以10 μL 的反應體系進行PCR 反應。反應條件為95 ℃預變性30 s，PCR 反應：95 ℃變性5 s，60 ℃延伸45 s，72 ℃退火10 s，進行45個循環(huán)。引物序列見表1，以GAPDH 作為內(nèi)參對照，結(jié)果以2－ΔΔCt表示mRNA 相對表達量。

表1 核心靶蛋白引物序列表

1.2.8 Western blot法檢測蛋白的表達

細胞接種至6 孔培養(yǎng)板中，用5 μmol/L 斑蝥素分別刺激細胞0、3、5、10、15 min，加入含1 mmol/L PMSF的RIPA 裂解液裂解細胞。12 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清，按照BCA 試劑盒說明書測定蛋白濃度。按每15 μL 蛋白樣品加入5 μL 蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性5 min 后，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品、半干轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗PI3K（1∶2 000）、Akt（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）在4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入山羊抗兔二抗（1∶100 000）室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次，每 次10 min。ECL 顯色液以1∶1 體積比混合滴在PVDF 膜上，使用凝膠成像拍照，利用Image J 軟件定量目標條帶的相對蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7 軟件進行統(tǒng)計學處理，以均數(shù)± 標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 靶點的篩選

從TCMSP 和Swiss Target Prediction 中共獲得斑蝥素的靶點53個，去除重復靶點后得到32個靶點。利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫和TTD 數(shù)據(jù)庫，選擇Relevance Score值大于中位數(shù)的為肝癌的靶點。從TTD 數(shù)據(jù)庫中獲取1 468 個，GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得8 408 個，將兩個數(shù)據(jù)庫中篩選出的靶點合并、去重后共得到8 408個肝癌的靶點，運用Venny 2.1 平臺取交集后得到31 個共同靶點，分別是PPP2R2A、ADORA2B、ABCB1、POLB、CASP3、PTPN1、HSD11B1、BIRC5、PTGES、OPRK1、PTGS2、FGFR4、GABRA1、STAR、OPRM1、PRKCA、ELANE、UGT2B7、PREP、BCL2、PPP5C、CDC25A、PRKCD、VDR、PPP1CA、HMGCR、CAMK4T、P53、PTEN、PPP1CC和BAX。

2.2 斑蝥素與肝癌PPI 網(wǎng)絡的構(gòu)建及核心靶點的篩選

上傳得到的交集靶基因至STRING 數(shù)據(jù)庫，然后下載數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡圖，結(jié)果見圖1，其中包含26 個節(jié)點和61 條連線，節(jié)點代表靶點，依據(jù)度值（Degree）設定，顏色由淺到深代表度值由小到大。對網(wǎng)連線則代表靶點之間的相互作用。節(jié)點顏色和大小絡中的節(jié)點進行拓撲分析得到度值、介度、緊密度的中位數(shù)分別為4、0.004 9、0.458 8，將同時滿足大于度值、介度、緊密度3個參數(shù)中位數(shù)的靶點列為核心靶點，參數(shù)見表2。由此推斷TP53、PTEN、CASP3等核心靶點在斑蝥素治療肝癌的過程中起著重要作用。

圖1 交集靶點PPI網(wǎng)絡圖

表2 核心靶點及相關(guān)參數(shù)

2.3 GO分類富集和KEGG通路富集分析

基于DAVID 數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行富集分析（P<0.05），以P值為篩選條件，選擇排名前十條繪制成氣泡圖，見圖2和圖3。GO 分類富集分析顯示，斑蝥素在治療肝癌的過程中參與了87 條生物過程（BP）（圖2a），主要包括蛋白質(zhì)去磷酸化、細胞增殖、細胞周期的調(diào)控等；涉及21 條分子功能（圖2b），主要為蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)磷酸酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性、蛋白磷酸酶2A結(jié)合、蛋白磷酸酶活性等。GO 分類富集分析得出16 條細胞組分（圖2c），主要包括細胞質(zhì)、細胞液、細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜、蛋白復合體等。

圖2 斑蝥素治療肝癌交集靶點的GO分析圖

KEGG 富集31 條信號通路，依據(jù)P值大小排名前二十的結(jié)果見圖3，主要涉及乙型肝炎通路、鞘脂類信號通路、PI3K/Akt 信號通路、MAPK 信號通路、細胞凋亡、p53信號通路等。

圖3 KEGG通路富集分析

2.4 斑蝥素治療肝癌的分子對接

將核心靶點度值（Degree）前6 的靶點進行分子對接，進一步驗證斑蝥素和肝癌的結(jié)合活性。結(jié)合自由能（Binding energy）可以評估受體和配體之間的親和性，一般認為結(jié)合能<0 kJ/mol 表明配體分子和受體蛋白能夠自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能

圖4 斑蝥素治療肝癌的分子對接圖

表3 斑蝥素治療肝癌關(guān)鍵靶點結(jié)合能

2.5 斑蝥素抑制人肝癌HepG2細胞的增殖

采用CCK 法檢測不同濃度的斑蝥素作用于HepG2細胞24、48、72 h后對其增殖的影響。結(jié)果與空白對照組（0 μmol/L）相比，斑蝥素能顯著抑制人肝癌HepG2 細胞的增殖，并呈時間和劑量依賴性。見圖5。

2.6 斑蝥素影響HepG2相關(guān)基因的表達

采用Real－time PCR 法檢測斑蝥素作用于HepG2細胞后核心靶點mRNA 的表達情況。結(jié)果與對照組相比，斑蝥素干預組（5 μmol/L）中ABCB1（2.46 ±0.64）（P=0.017 3 <0.05）、PTEN（1.30 ± 0.13）（P=0.032 5 <0.05）、PTGS2（1.42 ± 0.07）（P=0.022 3 <0.05）和TP53（1.43 ± 0.01）（P=0.000 0 <0.01）的mRNA 表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義，而CASP3（1.04 ± 0.12）（P=0.43）和PRKCD（1.11 ± 0.08）（P=0.58）的mRNA 表達差異不具有統(tǒng)計學意義，說明斑蝥素能夠上調(diào)ABCB1、PTEN、PTGS2 和TP53 的表達。見圖5。

圖5 斑蝥素對HepG2細胞增殖及核心靶蛋白mRNA表達的影響

2.7 斑蝥素對HepG2細胞PI3K/Akt信號通路的影響

5 μmol/L 斑 蝥 素 作 用 于HepG2 細 胞3、5、10、15 min 后，與空白對照組（0 min）相比，5 μmol/L 斑蝥素組的PI3K、Akt 蛋白表達顯著下調(diào)（P<0.05），說明斑蝥素對PI3K/Akt 信號通路具有抑制作用。見圖6。

圖6 斑蝥素對PI3K/Akt 信號通路的影響

3 討論

大量研究證明，斑蝥素對多種癌細胞具有抗腫瘤的活性，但其作用機制復雜，以往的研究多以單靶點、單通路為主。本研究運用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術(shù)，從分子角度全面分析了斑蝥素治療肝癌的潛在作用機制。結(jié)果顯示，斑蝥素可通過TP53、PTEN、PTGS2及ABCB1等多個核心靶點發(fā)揮作用。TP53（細胞腫瘤抗原p53）是一種重要的腫瘤抑制因子，可通過調(diào)節(jié)DNA修復、細胞周期阻滯等多種細胞反應防止癌癥的發(fā)生和發(fā)展［9］，部分肝癌的發(fā)生與p53基因的缺陷或突變密切相關(guān)［10］。TIAN 等［11］研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素可通過上調(diào)TP53 抑制癌細胞的增殖和促進凋亡。PTEN基因是一種具有雙特異性磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，其表達下調(diào)可導致腫瘤血管生成增加，促進腫瘤細胞的增殖［12］。PTGS2又稱環(huán)氧合酶－2（COX－2），在多種癌細胞中表達增加，研究表明COX－2 抑制劑對肝癌細胞有良好的抑制增殖及誘導凋亡功效［13］。而ABCB1在肝癌中高表達與肝癌的高耐藥性相關(guān)［14］。

GO分類富集分析結(jié)果顯示，斑蝥素發(fā)揮的肝癌治療作用與細胞凋亡和細胞周期密切相關(guān)，早期的研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素可通過下調(diào)β－catenin 和細胞周期蛋白（cyclin）的表達，誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯在G2/M 期，抑制肝癌細胞增殖和自我更新［5］，這也與本文的分析結(jié)果相一致。

KEGG 富集結(jié)果表明，共同靶點主要富集在PI3K/Akt、乙型肝炎通路、鞘脂類通路等。PI3K/Akt 在細胞的生長、增殖、代謝過程中發(fā)揮著重要作用，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展轉(zhuǎn)移和耐藥等方面密切相關(guān)［15］。有研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素通過下調(diào)EphB4 表達，調(diào)節(jié)JAK2/STAT3 和PI3K/Akt通路抑制肝癌［16］。為了進一步驗證網(wǎng)絡藥理學預測的科學性，本研究以HepG2 細胞為模型細胞，對預測的主要靶點和通路進行了實驗驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)斑蝥素能夠上調(diào)TP53、ABCB1、PTEN 和PTGS2 的mRNA 表達，下調(diào)PI3K/Akt 通路中PI3K、Akt 蛋白的表達，從而抑制HepG2細胞的增殖。

本研究運用網(wǎng)絡藥理學的方法分析了斑蝥素抗肝癌的潛在作用靶點及作用機制，并用分子對接技術(shù)和體外實驗進行了驗證。結(jié)果表明，斑蝥素抗肝癌具有多靶點、多通路的特點，主要通過上調(diào)TP53、PTEN、ABCB1和PTGS2 等靶點的mRNA 表達，抑制PI3K/Akt 信號通路的激活以及HepG2細胞的增殖實現(xiàn)抗肝癌的作用。