李思琦，趙兵，張磊，肖福龍，宮麗鴻?

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導(dǎo)致缺血性卒中、心肌梗死等動脈粥樣硬化性心腦血管病的重要病理學(xué)基礎(chǔ)［1］，它的主要病理特點(diǎn)是在動脈血管內(nèi)壁沉積一種類似粥樣的脂類物質(zhì)，引起血管腔狹窄，甚至阻塞，發(fā)生供血障礙。AS 不穩(wěn)定斑塊具有脂質(zhì)核較大、表面纖維帽薄，大量巨噬細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤等病理特征。細(xì)胞利用溶酶體途徑降解過多的或已受損的細(xì)胞器和損傷蛋白的生命現(xiàn)象被稱作自噬［2］。已有研究證明，自噬與多種心血管病緊密相關(guān)，尤其是AS 的發(fā)生和發(fā)展［3－5］。在形態(tài)學(xué)上，自噬一般分為自噬體的誘導(dǎo)、形成、運(yùn)輸、裂解等4 個(gè)階段。起初，在缺血、缺氧或者饑餓等狀態(tài)時(shí)，自噬在復(fù)雜的分子調(diào)控下被誘導(dǎo)；然后，自噬相關(guān)蛋白Beclin1 基因12/Atg5 和Atg8 泛素化系統(tǒng)參與進(jìn)來，將LC3 轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ，并與Atg12－Atg5－Atg16L 復(fù)合物結(jié)合成自噬體［6］；接著，將自噬體運(yùn)送至溶酶體；最后，自噬體與溶酶體融合降解其內(nèi)的廢物，分解的脂肪酸、氨基酸等有用物質(zhì)供機(jī)體回收再利用［7］，為細(xì)胞修復(fù)再生、某些細(xì)胞器的更新提供必需的原料，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。Atg5和LC3是自噬體形成至關(guān)重要的基因，二者都參與了對自噬活性的調(diào)控。自噬泡形成之初，由ATG12－ATG5－ATG16L形成的復(fù)合物與自噬泡外膜相結(jié)合，這種結(jié)合促進(jìn)自噬泡伸展擴(kuò)張［8］，同時(shí)還促使LC3向自噬泡募集。LC3是自噬體標(biāo)志性基因，可作為診斷指標(biāo)［9］，LC3B是LC3的亞型之一。適度自噬能抑制AS的形成與發(fā)展［10］。前期動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，搜風(fēng)祛痰中藥穩(wěn)斑湯具有抗AS及穩(wěn)定易損斑塊的作用［11－12］，因此，現(xiàn)通過給予ApoE基因敲除小鼠穩(wěn)斑湯的方法，觀察Atg5 和LC3B 的蛋白表達(dá)水平，從而探討穩(wěn)斑湯影響AS斑塊穩(wěn)定性的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

60只6周齡雄性ApoE 小鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（京）2020－0004。20 只6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（遼）2020－0001。本實(shí)驗(yàn)符合遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)（實(shí)驗(yàn)動物倫理審查編號：21000042020038）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

穩(wěn)斑湯組成：全蝎5 g，蜈蚣1 條，地龍15 g，陳皮15 g，法半夏15 g，白術(shù)15 g 和水蛭15 g。上述藥物均購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局。首先將藥物浸入常溫水中0.5 h，先武火后文火煎1 h，倒出藥液，煎煮3 次，將藥液合并，紗布過濾，100 ℃水浴濃縮至100 mL，4 ℃冰箱儲存，加工制成含生藥2 g/mL 的中藥濃縮液備用；阿托伐他汀片（規(guī)格：10 mg/片，輝瑞制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：EG6187）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

兔抗鼠Atg5（批號：49050）、LC3B（批號：30848），Signalway Antibody公司；辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG（批號：K1223），ApexBio 公司；SDS－PAGE 電泳液（批號：P0014B）、SDS－PAGE 凝膠配制試劑盒（批號：P0012A）、SDS－PAGE 蛋白上樣緩沖液（5 ×）（批號：P0015L）、Western 轉(zhuǎn)膜液（批號：P0021B）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0012）、RIPA 裂解液（強(qiáng)）（批號：P0013B）、超敏ECL 發(fā)光試劑盒（批號：P0018S），碧云天生物技術(shù)研究所。

SIS透射電鏡數(shù)字?jǐn)z像頭（TEM CCD Camera），德國EMSIS，型號：MORADA；電泳儀（EPS200型）、凝膠成像分析系統(tǒng)（Tanon－4200SF型），上海天能科技有限公司。

1.4 AS模型的制備

適應(yīng)性普食喂養(yǎng)60只ApoE基因敲除小鼠1周，然后進(jìn)行高脂喂養(yǎng)，飼料由沈陽于洪區(qū)盛旺牧業(yè)飼料廠提供。13周后，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表取4只處死，取腹主動脈血管，HE染色判斷造模是否成功。

1.5 分組與干預(yù)方法

隨機(jī)取50只造模成功的ApoE基因敲除小鼠，隨機(jī)分為模型組，穩(wěn)斑湯低、中、高劑量組，阿托伐他汀組，每組10 只，繼續(xù)高脂飲食。隨機(jī)選擇10 只C57 BL/6J 小鼠為空白對照組，普食喂養(yǎng)?？瞻讓φ战M和模型組給予生理鹽水0.3 mL/d。按照成人每日臨床推薦用藥劑量，按成人與小鼠體表面積折算系數(shù)0.002 6 折算小鼠用量，穩(wěn)斑湯各劑量組分別予穩(wěn)斑湯6.175、12.35、24.7 g/（kg·d），阿托伐他汀組予阿托伐他汀片25.4 mg/（kg·d）；高劑量組為中劑量組兩倍，中劑量組為低劑量組兩倍。每日灌胃1次，共13周。

1.6 標(biāo)本采集和處理

處死全部小鼠，剪開小鼠胸腔和腹腔，取出整條腹主動脈，清除主動脈外部脂肪，將主動脈?80 ℃冷凍保存于冰箱。

1.7 觀察指標(biāo)與方法

1.7.1 超微透射電鏡觀察自噬體

取主動脈弓，用移液槍抽取2.5%戊二醛進(jìn)行固定，將組織切成長寬均為1 mm 的小塊，放入盛有1 mL 4 ℃戊二醛固定液的EP 管中待用；脫水、包埋、超薄切片、染色，在透射電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.7.2 Western blot 法檢測Atg5 和LC3B 蛋白表達(dá)水平

取冰箱中主動脈組織融化，按組織凈重與裂解液1∶10的比例加入蛋白提取試劑，并用高速電動勻漿器在冰上進(jìn)行勻漿，勻漿后靜置于冰上20 min，10 000 r/min離心15 min，分離上清液，即為總蛋白備用。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，制備凝膠，加入等量上樣緩沖液，SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，封閉40 min，4 ℃孵育一抗（Atg5 稀釋比例1∶1 000，LC3B稀釋比例1∶500）過夜，室溫孵育二抗（稀釋比例1∶5 000）1 h，洗膜，ECL 發(fā)光，凝膠系統(tǒng)成像，使用Image J 軟件計(jì)算蛋白灰度值，并用目的蛋白灰度值和內(nèi)參灰度值的比值表示相應(yīng)目的蛋白表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 21.0 版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腹主動脈組織透射電鏡觀察結(jié)果

空白對照組可見少量自噬體，自噬體呈雙層膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，其中有內(nèi)容物；模型組無明顯自噬體；穩(wěn)斑湯各劑量組和阿托伐他汀組均觀察到有較多自噬體，其數(shù)量均高于模型組；其中阿托伐他汀組自噬體最多。見圖1。

圖1 各組小鼠腹主動脈組織透射電鏡下結(jié)構(gòu)（×5 000）

2.2 各組小鼠腹主動脈組織Atg5 和LC3B 蛋白表達(dá)水平比較

各組小鼠腹主動脈組織Atg5和LC3B蛋白電泳圖見圖2。與空白對照組相比，模型組小鼠腹主動脈組織Atg5 和LC3B 蛋白表達(dá)水平均降低（P<0.05）；與模型組相比，穩(wěn)斑湯各劑量組和阿托伐他汀組小鼠腹主動脈組織Atg5 和LC3B 蛋白表達(dá)水平均升高（P <0.05）。見表1。

圖2 各組小鼠腹主動脈組織中Atg5、LC3B蛋白表達(dá)電泳圖

表1 各組小鼠腹主動脈組織Atg5、LC3B蛋白表達(dá)水平比較（xˉ±s）

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化作為心肌梗死、冠心病的主要病理基礎(chǔ)，其本質(zhì)是慢性炎癥［13］。由于斑塊的不穩(wěn)定性，AS 斑塊破裂會導(dǎo)致急性心血管事件發(fā)生。因此，深入研究不穩(wěn)定斑塊易損性的機(jī)制，促使不穩(wěn)定斑塊向穩(wěn)定趨勢發(fā)展，是減少急性心血管事件發(fā)生的根本。

自噬是為保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞器完整性的一種自我防御保護(hù)機(jī)制［14］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，自噬在AS中有著不容忽視的作用，自噬與AS 斑塊脆弱性密切相關(guān)［15］，提高自噬水平可以抑制AS［16］，降低AS 斑塊脆弱性［17］。自噬這一進(jìn)程受自噬相關(guān)基因（Atg）的嚴(yán)格調(diào)控，其中Atg5 是自噬體形成進(jìn)程的重要基因之一，哺乳動物去除Atg5 能夠阻止自噬發(fā)生［18］。周仕霞等［19］研究發(fā)現(xiàn)，干擾Atg5 基因后，細(xì)胞自噬活性明顯降低。LC3 作為真核細(xì)胞Atg8 的同源基因，存在于自噬泡前體和自噬體膜的表面，它參與了自噬體形成，是確認(rèn)自噬發(fā)生的最直接證據(jù)［20］，其含量與自噬體數(shù)量呈正相關(guān)，檢測亞型LC3B 的蛋白可反映自噬程度［21］。目前認(rèn)為，適度自噬對AS斑塊具有保護(hù)作用。

他汀類藥物具有明確的穩(wěn)定斑塊、抗炎、抗氧化應(yīng)激、改善內(nèi)皮功能及抑制血栓形成等作用。阿托伐他汀片是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的新型他汀類藥物，是調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防AS、穩(wěn)定AS 斑塊的首選藥物。研究顯示，阿托伐他汀可通過AMPK 信號通路激活自噬抑制凋亡［22］，還可通過提高自噬，抑制巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)，減少脂質(zhì)沉積，使AS 斑塊更穩(wěn)定［23－24］。因此，本實(shí)驗(yàn)選用阿托伐他汀片為西藥對照藥。

本研究結(jié)果表明，在透射電鏡下發(fā)現(xiàn)，空白對照組有少量自噬體，說明在正常生理?xiàng)l件下，自噬處于一個(gè)基礎(chǔ)水平；與空白對照組比較，模型組無明顯自噬體，說明自噬處于很低水平。穩(wěn)斑湯各劑量組和阿托伐他汀組均有較多自噬體出現(xiàn)，且數(shù)量均高于模型組，說明穩(wěn)斑湯和阿托伐他汀組具有提高自噬水平的效果。此外，與空白對照組相比，模型組小鼠腹主動脈組織中Atg5、LC3B 蛋白表達(dá)水平明顯降低，說明AS 發(fā)生時(shí)，可導(dǎo)致Atg5、LC3B 蛋白表達(dá)水平的降低；而穩(wěn)斑湯各劑量組和阿托伐他汀組均不同程度地提高Atg5、LC3B蛋白表達(dá)水平，說明穩(wěn)斑湯和阿托伐他汀都提高了自噬相關(guān)蛋白活性。以上這些證據(jù)均說明穩(wěn)斑湯可通過上調(diào)Atg5、LC3B蛋白表達(dá)水平來提高自噬活性。

AS是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病名，中醫(yī)典籍未對此病名進(jìn)行記載，據(jù)其臨床表現(xiàn)可將其歸屬于“胸痹”等范疇。老年人恣食膏粱厚味，又年老體虛，久則易損脾胃之氣，使脾胃運(yùn)化輸布無權(quán)而釀生痰濁。痰濁日久浸漬在脈道中，或情志內(nèi)傷導(dǎo)致氣機(jī)不暢，可使血行失暢，脈絡(luò)不利，內(nèi)生瘀血，阻滯于心脈之中。隨著病程進(jìn)展，久病則損人體正氣，氣虛無法推動血液運(yùn)行，瘀血阻滯更甚，痰濁與瘀血互結(jié)，不能排出，積聚日久致內(nèi)生毒熱，熱極生內(nèi)風(fēng)。風(fēng)為百病之長，且善行數(shù)變，百病皆由痰作祟，風(fēng)痰內(nèi)動。運(yùn)用取類比象的方法，“風(fēng)”之“善行數(shù)變”之性，恰恰類似AS斑塊的不穩(wěn)定之性。宮麗鴻教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)提出“風(fēng)痰”是導(dǎo)致AS的主要病因［25］，故以“風(fēng)痰理論”為基礎(chǔ)，創(chuàng)新性地化裁《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中的逐風(fēng)湯，創(chuàng)搜風(fēng)祛痰中藥穩(wěn)斑湯治療以動脈粥樣硬化為基礎(chǔ)的心血管疾病，療效顯著。方中蜈蚣、全蝎、地龍三藥相須，兼具搜風(fēng)止痙、通絡(luò)止痛之效，共為君藥；陳皮、法半夏、白術(shù)三藥共用為臣藥，兼具燥濕健脾、理氣化痰之效；水蛭為佐藥，破血行瘀?？v觀全方，共奏搜風(fēng)祛痰、活血化瘀之功?，F(xiàn)代藥理研究顯示，蜈蚣不僅具有溶栓作用，還能抑制血管內(nèi)動脈血栓形成，改善心肌缺血［26］；全蝎具有抗凝、抗血栓、促纖溶的功效，并改善血液循環(huán)［27］，其所含的飽和脂肪酸具有抑制靜脈血栓形成、延緩AS 進(jìn)程的作用［28］；地龍具備抗凝、抗血栓的效用［29］，還能改善微循環(huán)，其所含蚓激酶有纖溶酶的活性；陳皮具有降低血脂、抗AS、保護(hù)心肌、抗炎及抗氧化的作用［30］；半夏具有抗炎、抗氧化的作用［31］，還能降低血黏度、提高紅細(xì)胞變形能力；白術(shù)具有調(diào)節(jié)脂代謝、抗動脈粥樣硬化的作用［32］；水蛭所含的水蛭素作為天然的凝血酶抑制劑，能抑制凝血酶與血小板結(jié)合，也具備抗凝［33］、抗血栓［34］的效用，還能調(diào)節(jié)脂代謝［35］。以上研究結(jié)果奠定了穩(wěn)斑湯干預(yù)AS的現(xiàn)代藥理學(xué)理論基礎(chǔ)。穩(wěn)斑湯基于整體觀，多途徑、多靶點(diǎn)地干預(yù)AS，為防治AS提供了新思路、新方法，具有臨床推廣價(jià)值。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)斑湯具有提高細(xì)胞自噬活性、抗AS的作用。干預(yù)Atg5、LC3B 蛋白表達(dá)或?qū)⒊蔀榉乐蜛S新靶點(diǎn)。提高Atg5、LC3B 蛋白表達(dá)水平，這可能是其增強(qiáng)AS斑塊穩(wěn)定性的分子機(jī)制之一，為更加明確穩(wěn)斑湯的作用靶點(diǎn)，仍需繼續(xù)在分子生物學(xué)、基因?qū)用鎸ζ溥M(jìn)行深入研究。