滕步偉 楊雨翰 郭增亞 張坤東 王曉峰 陳偉偉 裘正軍

（南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院第一附屬醫(yī)院暨連云港市第一人民醫(yī)院，連云港 222061）

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是最常見的癌癥之一，已成為導(dǎo)致美國癌癥相關(guān)死亡的第二位因素［1］。即便應(yīng)用了各種治療手段，包括手術(shù)切除和化療等輔助治療，PC的五年生存率也不超過5%，平均生存期僅為3~6個月［2］。既往研究表明，PC患者的高病死率主要是由于早期診斷困難、局部侵襲和早期轉(zhuǎn)移［3］。因此，尋找新的PC診斷標(biāo)志物并了解其潛在的作用機(jī)制至關(guān)重要。目前，免疫治療已成為腫瘤治療的重要手段，它可以通過激活免疫系統(tǒng)來攻擊腫瘤［4］。然而，許多對其他癌癥有顯著療效的免疫治療對PC的治療效果卻不理想［5］。小鼠和人類PC腫瘤微環(huán)境的特點之一是腫瘤中含有大量的非腫瘤成分，統(tǒng)稱為基質(zhì)［6］。在PC中，基質(zhì)占腫瘤總質(zhì)量的50%，并被證明能抑制自發(fā)性和治療性地誘導(dǎo)抗腫瘤免疫［7］。事實上，廣泛的免疫策略限制了免疫治療的效果，癌細(xì)胞的主要逃逸機(jī)制是通過分泌代謝物、細(xì)胞因子、免疫因子和趨化因子使PC對骨髓生成狀態(tài)敏感，從而改變臨床前和臨床結(jié)果。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macro‐phages，TAM）占免疫細(xì)胞總數(shù)的15%~20%。一般來說，循環(huán)中的單核細(xì)胞首先遷移到組織中，然后分化為常駐組織的巨噬細(xì)胞［8］。在微生物產(chǎn)物和細(xì)胞因子等環(huán)境因素的影響下，這些滯留巨噬細(xì)胞可以被激活，激活的巨噬細(xì)胞通常分為經(jīng)典激活的（M1）巨噬細(xì)胞和交替激活的（M2）巨噬細(xì)胞［9］。M1巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞-1（Th1）反應(yīng)。相反，M2巨噬細(xì)胞可以根據(jù)誘導(dǎo)信號的不同表現(xiàn)出不同表型，包括IL-4、IL-13、IL-10和糖皮質(zhì)激素［10］。在多數(shù)腫瘤中，巨噬細(xì)胞的表型與傷口愈合的分解階段一致，但TAM往往表現(xiàn)為免疫抑制表型。此外，對TAM轉(zhuǎn)錄組的表型分析表明，TAM表達(dá)了一些免疫抑制基因，包括精氨酸酶Ⅰ、IL-10、TGF-β等［11］。

效應(yīng)性T細(xì)胞的活化是構(gòu)成PC免疫治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細(xì)胞毒性CD8+效應(yīng)T細(xì)胞是腫瘤免疫反應(yīng)的核心，CD8+T細(xì)胞在腫瘤中的浸潤已被證實與胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）患者的預(yù)后有關(guān)［12］。然而，在大多數(shù)PC患者和小鼠中，CD8+T細(xì)胞罕見，其活化水平明顯降低，表明腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的浸潤和/或活性受到抑制［13］。

因此，本研究旨在探討免疫相關(guān)基因（immunerelated genes，IRGs）在預(yù)測預(yù)后方面的潛在臨床應(yīng)用價值及其作為PC治療生物標(biāo)志物的可能性。首先，將IRGs的表達(dá)與臨床數(shù)據(jù)相結(jié)合，利用計算方法評估PC患者的總生存期（overall survival，OS）。隨后系統(tǒng)分析IRGs的表達(dá)，并篩選出獨立的預(yù)測PC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。最后，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以探討其潛在的作用機(jī)制。本研究為PC的早期診斷和個體化免疫治療奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 從癌癥基因組圖譜（The cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）中獲取PC患者的原始基因表達(dá)和相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)。剔除沒有足夠臨床或（和）生存資料的樣本。此外，還需包含性別和美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）分期數(shù)據(jù)。考慮到TCGA數(shù)據(jù)庫中只有4個正常胰腺組織，本課題組從美國國立衛(wèi)生研究院共同基金建立的基因-組織表達(dá)（genotype-tissue expression，GTEx）數(shù)據(jù)庫中獲得了正常胰腺的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 差異基因分析 以|log2倍數(shù)變化|≥2和P<0.05作為篩查差異表達(dá)基因（differentially ex‐pressed gene，DEG）的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)http://bioconduc‐tor.org/packages/release/bioc/html/limma.html提供的“l(fā)imma”R軟件包，選擇DEG進(jìn)行進(jìn)一步分析。使用R平臺（3.5.2版）提供的“ggplwot2”繪制火山圖和熱圖。

1.2.2 風(fēng)險評分模型的建立 進(jìn)行歸一化和差異性分析。采用單變Cox模型進(jìn)行LASSO分析篩選出224個差異顯著并且與OS高度相關(guān)的IRGs。經(jīng)數(shù)據(jù)處理后，使用多變量Cox模型計算12個選定的關(guān)鍵IRGs的系數(shù)（βi）。建立由βi和IRGs mRNA表達(dá)組成的評分模型如下：風(fēng)險評分=∑5（βi×Expi）。該公式中計算了每個受試者i=1的風(fēng)險評分。以平均風(fēng)險得分為分界值，將所有符合條件的受試者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。利用Kaplan-Meier生存曲線分析高危和低?；颊叩念A(yù)后差異。

1.2.3 功能富集分析 使用“Metascape”和“clus‐terProfiler”網(wǎng)絡(luò)工具進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析，以研究IRGs參與的生物學(xué)過程和潛在的途徑［14］。

1.2.4 免疫細(xì)胞的組成及其與免疫相關(guān)基因的相關(guān)性CiberSort算法是一種利用轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)估計免疫細(xì)胞豐度的工具［15］。該軟件使用線性支持向量回歸（SVR）從基于特征矩陣的大量腫瘤樣本的轉(zhuǎn)錄譜中解卷積免疫細(xì)胞的各部分。用腫瘤免疫評估資源（tumor immune estimation resource，TIMER）工具建立IRGs與免疫細(xì)胞的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 PC免疫細(xì)胞組成 采用CiberSort計算每種免疫細(xì)胞的比例，結(jié)果如圖1A、B所示，靜息CD4+記憶T細(xì)胞、M0和M2巨噬細(xì)胞、T細(xì) 胞CD8和B細(xì) 胞 是最常見的5種免疫細(xì)胞。與非腫瘤胰腺組織（n=21）相比，PC組織（n=178）中靜息記憶CD4+T細(xì)胞、活化CD4記憶T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、靜息樹突狀細(xì)胞和活化樹突狀細(xì)胞明顯占優(yōu)勢（P<0.001）。與PC相比，非腫瘤組織中濾泡輔助T細(xì)胞、單核細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞占優(yōu)勢（P<0.001，圖1C）。

圖1 PC中免疫細(xì)胞的組成Fig.1 Compositions of immune cells in PC

2.2 DEG的鑒定 如圖2A、B所示，利用“l(fā)imma”R軟件包共鑒定出4 847個DEG，其中2 559個上調(diào)，2 288個下調(diào)。將從immport數(shù)據(jù)庫（https://www.immport.org/shared/home）下載的共4 678個IRGs與上述DEG取交集，產(chǎn)生了1 206個差異表達(dá)的IRGs（圖2C）。進(jìn)一步功能富集分析顯示炎癥相關(guān)通路最為富集，“白細(xì)胞遷移”“T細(xì)胞活化”和“細(xì)胞黏附正向調(diào)節(jié)”是最常見的生物學(xué)術(shù)語（圖3）。此外，KEGG分析表明，這些IRGs在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體和PI3K-Akt信號通路上最為富集（圖4）。

圖2 DEG鑒定Fig.2 Identification of DEG

圖3 生物過程、細(xì)胞成分和分子功能的GO分析Fig.3 GO analysis of biological process，cellular compo?nent and molecular function

圖4 最顯著的10條KEGG通路Fig.4 Top 10 most significant KEGG pathways

2.3 OS相關(guān)的免疫相關(guān)基因的鑒定 為探討IRGs表達(dá)與患者OS的關(guān)系，選取224個差異顯著（P<0.05）的IRGs進(jìn)行單因素回歸分析。與DEG功能富集分析的結(jié)果一致，OS相關(guān)的IRGs在與細(xì)胞相互作用和運動相關(guān)的基因本體論術(shù)語中也最為富集。此外，KEGG分析表明，PI3K-Akt途徑也最為富集（圖5）。

圖5 OS相關(guān)IRGs的鑒定Fig.5 Identification of OS-related IRGs

2.4 免疫相關(guān)中心基因的鑒定 為了鑒定出與PC的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)的IRGs，選擇與臨床預(yù)后顯著相關(guān)（P<0.05）的差異表達(dá)IRGs進(jìn)行進(jìn)一步分析。將這些差異表達(dá)IRGs進(jìn)行String分析，形成蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。將處于交叉點并且存在較多蛋白互作的基因認(rèn)定為HUB基因。PPI網(wǎng)絡(luò)顯示CDK1、Bub1和AURKB是3個HUB基因［見附圖1（www.immune99.com）及圖6A］。功能富集分析表明，這3個HUB基因積極參與了PI3KAkt途徑（圖6B）。

圖6 核心IRGs的鑒定Fig.6 Identification of HUB IRGs

2.5 臨床預(yù)后評估 采用單變量Cox模型，選取224個差異顯著（P<0.05）的IRGs進(jìn)行LASSO分析，篩選出與OS高度相關(guān)的IRGs。LASSO分析有助于在擬合廣義線性模型時選擇變量和進(jìn)行正則化，在一定程度上可以避免過擬合。此外，由于LASSO分析的復(fù)雜度取決于系數(shù)（γ），可以通過根據(jù)其大小進(jìn)行懲罰比例來獲得變量較少的模型。最后，得到相對較少的密切相關(guān)指標(biāo)，繪制出部分可能性偏差與對數(shù)log（γ）的關(guān)系圖。

根據(jù)多變量Cox和LASSO回歸分析建立一個預(yù)后標(biāo)志，將PC患者分為兩組，兩組的OS臨床結(jié)果不同（圖7）。公式如下：CD2AP表達(dá)×1.738 56+IL20RB表 達(dá)×0.375 56+MYEOV表 達(dá)×0.592 51+NUSAP1表達(dá)×2.946 30+PCDH1表達(dá)×（?2.525 06）+RAB27B表達(dá)×1.036 62+TNFSF10表達(dá)×1.652 40+TOP2A表達(dá)×（?1.556 16）+TPX2表達(dá)×2.152 52+TYK2表達(dá)×（?3.714 78）+WNT7A表達(dá)×0.527 38+BUB1B表達(dá)×（?2.276 12）。

圖7 OS相關(guān)IRGs的LASSO回歸模型Fig.7 LASSO regression model of OS-related IRGs

免疫相關(guān)預(yù)后指數(shù)是根據(jù)潛在的離散臨床結(jié)果區(qū)分PC患者的關(guān)鍵工具（圖8A~C）。受試者操作特征曲線下的面積值為0.802，表明IRGs對OS具有相當(dāng)好的判斷預(yù)后能力（圖9）。

圖8 臨床預(yù)后的評估Fig.8 Assessment of clinical outcomes

圖9 IRGs的受試者工作特征曲線Fig.9 Receiver operating characteristic curve of IRGs

2.6 OS相關(guān)的免疫相關(guān)基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性 用Kaplan-Meier分析評估了PC患者OS與12種IRGs表達(dá)的關(guān)系（圖10）?；赥IMER這一綜合分析腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，進(jìn)一步分析12種IRGs的表達(dá)與免疫浸潤的相關(guān)性。如圖11A、B所示，RAB27B與CD4+T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，而TYK2與CD4+T細(xì)胞呈正相關(guān)。

圖10 12個重要IRGs分層的患者預(yù)后Kaplan-Meier分析Fig.10 Kaplan-Meier analysis of PS of patients stratified by expression of 12 selected key IRGs

圖11 重要IRGs與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性Fig.11 Pearson correlation between key IRGs and immune cells infiltrating

3 討論

雖然腫瘤的免疫治療已經(jīng)對包括黑色素瘤和小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的多種癌癥顯示出良好的效果。然而，到目前為止，它對大多數(shù)PC患者并不敏感。因此，有必要對PC中腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞和免疫基因進(jìn)行系統(tǒng)研究，揭示其臨床意義和相互關(guān)系。事實上，PC的五年生存率非常低，對免疫基因的研究揭示了它們與臨床預(yù)后存在相關(guān)性，有助于評估PC的OS。本研究獲得了腫瘤和非腫瘤組織之間的DEG，并研究了它們之間的相互作用。系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析進(jìn)一步探討了它們的分子機(jī)制。最重要的是，根據(jù)篩選和差異表達(dá)的IRGs，提出了一個單獨的后處理功能來確定免疫細(xì)胞浸潤并評估PC患者的潛在臨床結(jié)果。

根據(jù)TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫對免疫細(xì)胞組成的分析表明，靜息狀態(tài)下的CD4+記憶性T細(xì)胞、M0和M2巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞是主要的免疫細(xì)胞。以前的研究表明，PC過去被描述為冷瘤，而TAM是PC組織中最重要的免疫細(xì)胞，占免疫細(xì)胞的15%~20%［16-17］。許多其他證據(jù)表明，TAM主要是M2巨噬細(xì)胞，可以誘導(dǎo)PC的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）［18-19］。同時，這些M2巨噬細(xì)胞還能分泌CCL22和IL-10等因子，從而抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的功能［20-21］。此外，巨噬細(xì)胞來源的外泌體也能誘導(dǎo)PC產(chǎn)生耐藥性［22］。

據(jù)報道，腫瘤內(nèi)CD4+Th2細(xì)胞浸潤和FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞也與PC患者生存率下降有關(guān)［23］。此外，激活的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以誘導(dǎo)M2樣巨噬細(xì)胞分化，KPC小鼠模型中巨噬細(xì)胞的耗盡被證明能顯著減少腫瘤轉(zhuǎn)移，并與CD4+和CD25+T細(xì)胞水平的降低有關(guān)［24-25］。

綜上所述，PC是一種典型的冷腫瘤，其免疫微環(huán)境主要由促癌的CD4+T細(xì)胞和TAM浸潤。針對PD-1、CTLA4等免疫檢查點的免疫治療主要促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的免疫抑制，對黑色素瘤、小細(xì)胞肺癌等熱性腫瘤有較好的治療效果。本研究表明CD4+T細(xì)胞是PC的主要細(xì)胞。因此，以抑制T細(xì)胞和TAM為靶點的免疫治療對PC可能更為有效。

本課題組對免疫基因的分析表明，差異表達(dá)的免疫基因和OS相關(guān)的免疫基因主要集中在PI3KAkt信號通路上。有趣的是，PI3K-Akt mTOR被證明是誘發(fā)PC的關(guān)鍵信號通路，并且在PC中被頻繁激活［26］。

為了建立簡便的方法監(jiān)測PC患者的免疫狀態(tài)并預(yù)測其臨床預(yù)后，本課題組提出了一種基于免疫的預(yù)后標(biāo)志物，包括12個與OS相關(guān)的HUB IRGs。關(guān)于TNFSF10、CD2AP、PCDH1、MYEOV、NUSAP1在PC中的作用和機(jī)制的研究尚未見報道。其中，CD2AP被報道能誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化，PCDH1可以與Smad3結(jié)合從而抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄［27-28］。

TOP2A是β-連環(huán)蛋白的共同激活劑，可以激活PCEMT過程［29］。IL20RB、BUB1B和WNT7A的高表達(dá)與PC患者較短的生存期相關(guān)［30-33］，但本課題組基于TCGA數(shù)據(jù)庫的分析表明，BUB1B的高表達(dá)與較好的預(yù)后相關(guān)。TPX2 mRNA和蛋白在PC細(xì)胞或腫瘤中高表達(dá)，以往的研究表明，用TPX2特異性RNA敲除TPX2可以有效抑制培養(yǎng)液中PC細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)其凋亡，抑制PC在軟瓊脂和裸鼠體內(nèi)的生長［34-35］。

在12個基因中，TYK2與CD4 T細(xì)胞呈正相關(guān)，而RAB27B與CD4T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)［36］。TYK2屬于JAK家族，可以激活STAT3，促進(jìn)與腫瘤生長、存活和免疫抑制相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達(dá)［37］。此外，TYK2信號在IL-23誘導(dǎo)的γδ T細(xì)胞分泌IL-17中也起關(guān)鍵作用，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放IL-27［38］。同時，IL-27可導(dǎo)致Th1/Tc1、Th2/Tc2、Th17/Tc17、Th9和Th22細(xì)胞顯著升高［39］。更重要的是，RAB27B被證明是乳腺癌和肺腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，并在PC細(xì)胞的侵襲、增殖和凋亡以及化療耐藥方面發(fā)揮重要作用［40-42］。本研究表明RAB27B的表達(dá)與CD4+T細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān)。但RAB27B對CD4+T細(xì)胞的抑制作用還有待進(jìn)一步研究。總之，通過基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫對PC患者的分析，本研究獲得了差異表達(dá)和OS相關(guān)的核心免疫基因，然后建立了預(yù)后模型。此外，本課題組還分析了免疫細(xì)胞在PC中的浸潤和聚集及其與上述基因的關(guān)聯(lián)。