田曉靜 薛宏峰 蔣 輝 姚雨葉（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，常州 213003）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，其病理特征主要為炎癥反應(yīng)、滑膜增生和關(guān)節(jié)軟骨損傷等，嚴(yán)重影響患者身心健康［1］?；こ衫w維細(xì)胞主要位于滑膜組織，不僅可分泌大量炎癥細(xì)胞因子參與滑膜炎癥反應(yīng)，還具有腫瘤細(xì)胞樣特點(diǎn)，其增殖和遷移能力明顯強(qiáng)于正常人滑膜細(xì)胞，是RA治療的主要靶細(xì)胞［2-3］。因此，抑制或減弱滑膜成纖維細(xì)胞增殖能力對(duì)RA治療具有重要意義。環(huán)狀RNA（circRNA）是一類呈閉合環(huán)狀的非編碼RNA，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有高度保守性，參與細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等生命活動(dòng)調(diào)控，在人類多種疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用［4-5］。有報(bào)道稱，hsa_circ_0044235在RA患者外周血中表達(dá)降低，外周血hsa_circ_0044235水平可能是診斷RA的生物標(biāo)志物［6］。但hsa_circ_0044235對(duì)RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖和遷移等惡性表型的影響及分子機(jī)制尚未闡明。

多數(shù)circRNA含有與微小RNA（miRNA）互補(bǔ)的核苷酸序列，可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA與miRNA靶向結(jié)合調(diào)控miRNA靶基因表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能［7］。Circular RNA Interactome生物在線軟件預(yù)測(cè)顯示，hsa_circ_0044235可靶向結(jié)合miR-338-5p。研究顯示，上調(diào)miR-338-5p表達(dá)可靶向抑制活化T細(xì)胞核因子5（NFAT5）表達(dá)促進(jìn)RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，miR-338-5p是RA治療的潛在分子靶點(diǎn)［8］。本研究以滑膜成纖維細(xì)胞MH7A為研究對(duì)象，采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞建立滑膜成纖維細(xì)胞損傷模型，觀察hsa_circ_0044235對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞增殖和遷移的影響及其能否靶向調(diào)控miR-338-5p發(fā)揮作用，以期為RA治療提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 滑膜成纖維細(xì)胞系MH7A（上海通派生物科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶公司）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技公司）；LipofectamineTM2000試劑盒和Trizol試劑（美國(guó)Invit‐rogen公司）；PCR引物、hsa_circ_0044235過(guò)表達(dá)載體（pcDNA-hsa_circ_0044235）、空載體（pcDNA）、miR-338-5p模擬物（mimics）、模擬對(duì)照序列（miRNC，上海生工生物工程有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒（大連寶生物工程公司）；上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）和GAPDH多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組 復(fù)蘇MH7A細(xì)胞，采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基（常規(guī)培養(yǎng)基）培養(yǎng)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MH7A細(xì)胞以5.0×105個(gè)/孔接種于6孔板，LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-hsa_circ_0044235、共 轉(zhuǎn) 染pcDNAhsa_circ_0044235與miR-NC、pcDNA-hsa_circ_004-4235與miR-338-5p mimics，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞備用。未轉(zhuǎn)染的MH7A細(xì)胞分為對(duì)照組（Con組）和LPS組，Con組細(xì)胞采用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，LPS組細(xì)胞采用含1.0 mg/L LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)［9］。轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-hsa_circ_0044235、共轉(zhuǎn)染pcDNA-hsa_circ_0044235與miR-NC、pcDNA-hsa_circ_0044235與miR-338-5p mimics的MH7A細(xì)胞均采用含1.0 mg/L LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)，記為L(zhǎng)PS+pcDNA組、LPS+pcDNAhsa_circ_0044235組、LPS+pcDNA-hsa_circ_0044235+miR-NC組、LPS+pcDNA-hsa_circ_0044235+miR-338-5p組。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)hsa_circ_0044235和miR-338-5p表達(dá) 將未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染后的MH7A細(xì)胞均以5.0×104個(gè)/孔接種于24孔板，按1.2.1進(jìn)行分組處理，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃5 min，95℃10 s，58℃30 s，72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)。hsa_circ_0044235正向引物：5'-GCGATAG‐GCTAGGCGTAGAG-3'，反向引物：5'-CGACTACTACGACATACAGGCGG-3'；GAPDH正向引物：5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，反向引物：5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'；miR-338-5p正 向 引物：5'-GAGCTCCGAGCAATTCTCCTGTGTC-3'，反向引物：5'-CTCGAGTACAGCATCCCTCCCAAC-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。2?ΔΔCt計(jì) 算相對(duì)表達(dá)。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染后的MH7A細(xì)胞均以5.0×103個(gè)/孔接種于6孔板，按1.2.1分組處理，2 d/次換液，培養(yǎng)14 d后棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡觀察，統(tǒng)計(jì)超過(guò)50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 將未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染后的MH7A細(xì)胞均以5.0×104個(gè)/孔接種于24孔板，按1.2.1進(jìn)行處理，培養(yǎng)24 h后，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，PBS清洗2次。加1 ml 70%乙醇混懸細(xì)胞，4℃固定12 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加1 ml PBS重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加0.5 μl PI 37℃孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染后的MH7A細(xì)胞均以5.0×103個(gè)/孔接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后，采用200μl移液器槍頭在培養(yǎng)板底部沿中軸劃兩條平行線，PBS清洗，除去劃痕間細(xì)胞，測(cè)量劃痕間距，記為d0h。按1.2.1分組處理，培養(yǎng)24 h后再次測(cè)量細(xì)胞間距，記為d24h，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（d0h?d24h）/d0h×100%。

1.2.6 Western blot檢 測(cè)E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá) 將未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染后的MH7A細(xì)胞均以5.0×104個(gè)/孔接種于24孔板，按1.2.1處理，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，RIPA試劑提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，行10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別置于E-cadherin（1∶500）、N-cadherin（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）一抗孵育液中4℃孵育過(guò)夜，置于山羊抗兔二抗（1∶1 000）孵育液37℃孵育1 h，顯影液避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 根據(jù)Circular RNA Interactome生物在線軟件預(yù)測(cè)顯示的miR-338-5p與hsa_circ_0044235結(jié)合 位點(diǎn) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，插入pmirGLO質(zhì)粒，構(gòu)建hsa_circ_0044235野生型熒光素報(bào)告載體（WT-hsa_circ_0044235），同時(shí)采用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)突變后插入pmirGLO質(zhì)粒，構(gòu)建hsa_circ_0044235野生型熒光素報(bào)告載體（MUT-hsa_circ_0044235），該過(guò)程由上海生工生物工程有限公司完成。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MH7A細(xì)胞以5.0×105個(gè)/孔接種于6孔板，LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-hsa_circ_0044235與miR-NC或miR-338-5p mimics、MUT-hsa_circ_0044235與miR-NC或miR-338-5p mimics，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞并裂解，離心（3 500 r/min、5 min），取上清，參照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MH7A細(xì) 胞hsa_circ_0044235和miR-338-5p表達(dá) 與Con組比較，LPS組MH7A細(xì)胞hsa_circ_0044235表達(dá)降低（P<0.05），而miR-338-5p表達(dá)升高（P<0.05）。與LPS+pcDNA組比較，LPS+pcDNAhsa_circ_0044235組MH7A細(xì) 胞hsa_circ_0044235表達(dá)升高（P<0.05），而miR-338-5p表達(dá)降低（P<0.05）。LPS組 和LPS+pcDNA組MH7A細(xì) 胞hsa_circ_0044235和miR-338-5p表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表1）。

表1 MH7A細(xì)胞hsa_circ_0044235和miR-338-5p表達(dá)（±s，n=3）Tab.1 Expressions of hsa_circ_0044235 and miR-338-5p in MH7A cells（±s，n=3）

表1 MH7A細(xì)胞hsa_circ_0044235和miR-338-5p表達(dá)（±s，n=3）Tab.1 Expressions of hsa_circ_0044235 and miR-338-5p in MH7A cells（±s，n=3）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05；compared with LPS+pcDNA group，3）P<0.05.

Groups Con LPS LPS+pcDNA LPS+pcDNA-hsa_circ_0044235 F P hsa_circ_0044235 1.00±0.00 0.11±0.021）0.10±0.02 0.81±0.062）3）598.273 0.000 miR-338-5p 1.00±0.00 6.04±0.201）6.06±0.23 1.43±0.082）3）945.413 0.000

2.2 過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞克隆形成和細(xì)胞周期的影響 與Con組比較，LPS組MH7A細(xì)胞克隆形成數(shù)增加（P<0.05），細(xì)胞周期G0~G1期縮短（P<0.05），S期延長(zhǎng)（P<0.05），而G2~M期無(wú)明顯變化（P>0.05）。與LPS+pcDNA組比較，LPS+pcDNA-hsa_circ_0044235組MH7A細(xì)胞克隆形成數(shù)減少（P<0.05），細(xì)胞周期G0~G1期延長(zhǎng)（P<0.05），S期縮短（P<0.05），而G2~M期無(wú)明顯變化（P>0.05）。LPS組和LPS+pcDNA組MH7A細(xì)胞克隆形成數(shù)和細(xì)胞周期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖1、圖2、表2）。

表2 hsa_circ_0044235對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞克隆形成和細(xì)胞周期的影響（±s，n=3）Tab.2 Effect of hsa_circ_0044235 on LPS-induced MH7A cells clone formation and cell cycle（±s，n=3）

表2 hsa_circ_0044235對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞克隆形成和細(xì)胞周期的影響（±s，n=3）Tab.2 Effect of hsa_circ_0044235 on LPS-induced MH7A cells clone formation and cell cycle（±s，n=3）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05；compared with LPS+pcDNA group，3）P<0.05.

Groups Con LPS LPS+pcDNA LPS+pcDNA-hsa_circ_0044235 FP Number of clones formed 100.00±3.74 270.00±10.421）272.33±11.59 135.67±4.992）3）342.791 0.000 Cell cycle（%）G0~G1 68.32±1.03 41.76±0.971）41.78±0.92 60.49±1.012）3）561.485 0.000 S 23.20±1.13 49.72±2.411）49.74±2.37 31.24±1.142）3）153.990 0.000 G2~M 8.48±0.83 8.52±0.79 8.48±0.79 8.27±0.82 0.059 0.980

圖1 LPS誘導(dǎo)的過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235的MH7A細(xì)胞克隆形成情況Fig.1 Clone formation of LPS-induced MH7A cells overexpressed hsa_circ_0044235

圖2 LPS誘導(dǎo)的過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235的MH7A細(xì)胞周期情況Fig.2 Cell cycle of LPS-induced MH7A cells over-ex?pressed hsa_circ_0044235

2.3 過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞遷移的影響 與Con組比較，LPS組MH7A細(xì)胞劃痕愈合率升高（P<0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)降低（P<0.05），N-cadherin蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。與LPS+pcDNA組比較，LPS+pcDNA-hsa_circ_0044235組MH7A細(xì)胞劃痕愈合率降低（P<0.05），E-cad‐herin蛋白表達(dá)升高（P<0.05），N-cadherin蛋白表達(dá)降低（P<0.05）。LPS組和LPS+pcDNA組各檢測(cè)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖3、表3）。

表3 過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞遷移的影響（±s，n=3）Tab.3 Effect of over-expression of hsa_circ_0044235 on migration of MH7A cells induced by LPS（±s，n=3）

表3 過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞遷移的影響（±s，n=3）Tab.3 Effect of over-expression of hsa_circ_0044235 on migration of MH7A cells induced by LPS（±s，n=3）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with LPS group，2）P<0.05；compared with LPS+pcDNA group，3）P<0.05.

Groups Con LPS LPS+pcDNA LPS+pcDNA-hsa_circ_0044235 FP Scratch healing rate（%）52.61±4.62 88.91±6.251）89.05±6.30 63.51±4.832）3）32.909 0.000 E-cadherin 0.75±0.07 0.14±0.021）0.14±0.02 0.57±0.052）3）139.805 0.000 N-cadherin 0.21±0.02 0.87±0.071）0.87±0.07 0.34±0.032）3）130.622 0.000

圖3 LPS誘導(dǎo)的過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235的MH7A細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)、遷移情況Fig.3 Protein expressions of E-cadherin and N-cadherin and migration in LPS-induced MH7A cells overexpressed hsa_circ_0044235

2.4 hsa_circ_0044235靶向調(diào)控miR-338-5p表達(dá)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，hsa_circ_0044235與miR-338-5p核苷酸序列存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)（圖4）。共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-hsa_circ_0044235與miR-338-5p的細(xì)胞熒光素酶活性低于共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-hsa_circ_0044235與miR-NC的細(xì)胞（0.23±0.02vs1.03±0.07，t=19.033，P<0.05），而共轉(zhuǎn)染MUT-hsa_circ_0044235與miR-338-5p的細(xì)胞與共轉(zhuǎn)染MUT-hsa_circ_0044235與miR-NC的細(xì)胞熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.96±0.05vs1.00±0.06，t=0.887，P=0.425），說(shuō)明hsa_circ_0044235可與miR-338-5p靶向結(jié)合。

圖4 hsa_circ_0044235和miR-338-5p的互補(bǔ)序列Fig.4 Complementary sequences of hsa_circ_0044235 and miR-338-5p

2.5 過(guò)表達(dá)miR-338-5p逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞克隆形成和細(xì)胞周期的影響 與LPS+pcDNA-hsa_circ_0044235+miR-NC組比較，LPS+pcDNA-hsa_circ_0044235+miR-338-5p組MH7A細(xì)胞miR-338-5p表達(dá)升高（P<0.05），克隆形成數(shù)增加（P<0.05），細(xì)胞周期G0~G1期縮短（P<0.05），S期延長(zhǎng)（P<0.05），而G2~M期無(wú)明顯變化（P>0.05，圖5、表4）。

圖5 LPS誘導(dǎo)的過(guò)表達(dá)miR-338-5p和hsa_circ_0044235的MH7A細(xì)胞克隆形成、細(xì)胞周期Fig.5 Clone formation and cell cycle of LPS-induced MH7A cells over-expressed miR-338-5p and hsa_circ_0044235

表4 過(guò)表達(dá)miR-338-5p可逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞克隆形成和細(xì)胞周期的影響（±s，n=3）Tab.4 Over-expression of miR-338-5p reversed effect of over-expression of hsa_circ_0044235 on clone formation and cell cycle of MH7A cells induced by LPS（±s，n=3）

表4 過(guò)表達(dá)miR-338-5p可逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞克隆形成和細(xì)胞周期的影響（±s，n=3）Tab.4 Over-expression of miR-338-5p reversed effect of over-expression of hsa_circ_0044235 on clone formation and cell cycle of MH7A cells induced by LPS（±s，n=3）

Note：Compared with LPS+pcDNA-hsa_circ_0044235+miR-NC group，1）P<0.05.

Groups LPS+pcDNA-hsa_circ_0044235+miR-NC LPS+pcDNA-hsa_circ_0044235+miR-338-5p tP hsa_circ_0044235 0.82±0.07 0.80±0.081）0.326 0.761 miR-338-5p 1.43±0.09 5.40±0.201）31.353 0.000 Number of clones formed 135.00±5.10 244.00±9.091）18.113 0.000 Cell cycle（%）G0~G1 60.47±0.99 51.45±0.891）11.736 0.000 S 31.24±1.08 40.21±1.111）10.032 0.001 G2~M 8.29±0.83 8.34±1.15 0.061 0.954

2.6 過(guò)表達(dá)miR-338-5p可逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞遷移的影響 如表5、圖6所示，與LPS+pcDNA-hsa_circ_0044235+miR-NC組比較，LPS+pcDNA-hsa_circ_0044235+miR-338-5p組MH7A細(xì)胞劃痕愈合率升高（P<0.05），Ecadherin蛋白表達(dá)降低（P<0.05），N-cadherin蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。

圖6 LPS誘導(dǎo)的過(guò)表達(dá)miR-338-5p和hsa_circ_0044235的MH7A細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)及遷移Fig.6 Protein expressions of E-cadherin and N-cadherin and migration in LPS-induced MH7A cells overexpressed miR-338-5p and hsa_circ_0044235

表5 過(guò)表達(dá)miR-338-5p可逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞遷移的影響（±s，n=3）Tab.5 Over-expression of miR-338-5p reversed effect of over-expression of hsa_circ_0044235 on migration of MH7A cells induced by LPS（±s，n=3）

表5 過(guò)表達(dá)miR-338-5p可逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞遷移的影響（±s，n=3）Tab.5 Over-expression of miR-338-5p reversed effect of over-expression of hsa_circ_0044235 on migration of MH7A cells induced by LPS（±s，n=3）

Note：Compared with LPS+pcDNA-hsa_circ_0044235+miR-NC group，1）P<0.05.

Groups LPS+pcDNA-hsa_circ_0044235+miR-NC LPS+pcDNA-hsa_circ_0044235+miR-338-5p tP Scratch heal‐ing rate（%）63.66±4.90 82.11±7.491）3.570 0.023 E-cadherin 0.58±0.05 0.23±0.021）11.257 0.000 N-cadherin 0.34±0.03 0.74±0.061）10.328 0.000

3 討論

circRNA在真核生物中廣泛存在，參與骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)、滑膜細(xì)胞增殖和遷移等過(guò)程，是骨關(guān)節(jié)炎靶向治療的潛在分子靶點(diǎn)［10-11］。hsa_circ_0044235是與炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的一種circRNA，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種炎癥性疾病中起重要調(diào)控作用［12］。已有研究顯示，hsa_circ_0044235在骨關(guān)節(jié)炎患者外周血中表達(dá)降低［6］，但hsa_circ_0044235影響骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖和遷移等惡性表型的相關(guān)報(bào)道較少。

LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，可誘導(dǎo)滑膜成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)，引起細(xì)胞增生。本研究顯示，LPS可促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞增殖和遷移，與既往報(bào)道結(jié)果一致［13］；LPS抑制了滑膜成纖維細(xì)胞hsa_circ_0044235表達(dá)，而過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235減弱了LPS誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞增殖和遷移能力，阻滯了細(xì)胞周期，提示hsa_circ_0044235可能是骨關(guān)節(jié)炎治療的分子靶點(diǎn)，通過(guò)靶向上調(diào)其表達(dá)可有效抑制骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展進(jìn)程。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是細(xì)胞失去上皮極性而獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程，此過(guò)程中上皮標(biāo)志物如E-cadherin表達(dá)降低，而間質(zhì)標(biāo)志物如N-cadherin表達(dá)升高，骨架改變，遷移能力增強(qiáng)［14-15］。本研究顯示，過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235后，LPS誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)升高，而N-cadherin蛋白表達(dá)降低，提示過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235可能通過(guò)抑制細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程抑制LPS誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞遷移。

為進(jìn)一步探究過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235抑制LPS誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制，本研究采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)hsa_circ_0044235可靶向結(jié)合miR-338-5p；同時(shí)，過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235抑制了LPS誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞miR-338-5p表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明hsa_circ_0044235靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-338-5p表達(dá)。miR-338-5p在RA組織和細(xì)胞中高表達(dá)，通過(guò)直接下調(diào)軟脂酰化磷蛋白促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、侵襲和促炎細(xì)胞因子表達(dá)［16］；下調(diào)miR-338-5p可直接靶向上調(diào)蛋白聚糖降解酶-9抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖和遷移［17］。表明miR-338-5p是RA發(fā)生發(fā)展的不利的因素，可作為RA治療分子靶點(diǎn)，通過(guò)靶向抑制其表達(dá)延緩RA發(fā)展。本研究還顯示，LPS可促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞miR-338-5p表達(dá)，而過(guò)表達(dá)miR-338-5p逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235對(duì)LPS誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程及遷移的抑制作用，提示hsa_circ_0044235可能通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控miR-338-5p影響LPS誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程和遷移。

綜上，LPS可促進(jìn)膜成纖維細(xì)胞增殖和遷移，而過(guò)表達(dá)hsa_circ_0044235可有效抑制LPS誘導(dǎo)的膜成纖維細(xì)胞增殖和遷移，其作用機(jī)制可能與靶向抑制miR-338-5p表達(dá)有關(guān)，hsa_circ_0044235/miR-338-5p軸可能為RA治療提供新的靶點(diǎn)。