董海蕓 鄭君波 張鈺君 梅 峰③（青海大學(xué)附屬醫(yī)院營養(yǎng)科，西寧 810000）

糖尿病腎病是糖尿病的常見并發(fā)癥，嚴重威脅人類生命健康。糖尿病患者長期處于高血糖狀態(tài)，高糖可引起腎小管上皮細胞損傷，這也是導(dǎo)致糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的主要原因［1］。腎小管上皮細胞損傷包括炎癥損傷、氧化應(yīng)激損傷及細胞凋亡等［2］。探究影響高糖誘導(dǎo)的腎小管生皮細胞損傷的分子機制，可為糖尿病腎病的治療提供分子靶點。長鏈非編碼RNA（lncRNA）和微小RNA（miRNA）是兩類非編碼RNA，且lncRNA可發(fā)揮miRNA分子海綿作用調(diào)控miRNA靶基因的表達，進而發(fā)揮生物學(xué)作用［3］。CASC9是一種lncRNA，參與多種疾病發(fā)展進程。研究顯示，CASC9在脊髓損傷大鼠和脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞PC12中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可減輕脊髓損傷大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，并減少細胞凋亡，其作用機制與靶向結(jié)合miR-383-5p并促進LDHA表達有關(guān)［4］；LPS抑制人小氣道上皮細胞（HSAECs）中CASC9表達，上調(diào)CASC9可通過調(diào)節(jié)miR-195-5p/PDK4改 善 膿 毒 癥 肺 損 傷［5］。然 而，CASC9能否影響高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞損傷還未知。

LncBase Predicted v.2靶基因在線軟件預(yù)測顯示，CASC9可能靶向結(jié)合miR-513a-5p。研究顯示，miR-513a-5p在敵敵畏誘導(dǎo)的人腎小管上皮細胞HK-2中表達上調(diào)，過表達miR-513a-5p可通過靶向抑制Bcl-2促進敵敵畏誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡［6］。但miR-513a-5p能否影響高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞損傷也還未知。本研究建立高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞HK-2損傷模型，觀察CASC9和miR-513a-5p對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞炎癥因子表達和細胞凋亡的影響及CASC9能否靶向miR-513a-5p發(fā)揮作用，以期為糖尿病腎病的治療提供分子靶標。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎小管上皮細胞HK-2（武漢普諾賽生命科技有限公司）；胎牛血清（杭州四季青）；低糖DMEM培養(yǎng)基、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒（北京索萊寶）；LipofectamineTM2000試劑盒和Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；CASC9過表達載體（pcDNA-CASC9）、空載體（pcDNA）、miR-513a-5p抑制劑（anti-miR-513a-5p）、抑制劑陰性序列（anti-miR-NC）、miR-513a-5p模擬物（mimics）、模擬對照序列（miR-NC）及PCR引物（上海生工）；RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒（大連寶生物）；IL-6和TNF-α試劑盒（南京建成）；兔抗活化的半胱天冬酶（cleaved-caspase）3、cleaved-caspase9和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（中國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 復(fù)蘇HK-2細胞，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)箱條件：溫度37℃、CO2體積分數(shù)5%、濕度97%。當細胞生長密度達到90%時，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 RT-qPCR檢 測CASC9和miR-513a-5p表達 取6孔板接種HK-2細胞（5.0×105個/孔），培養(yǎng)12 h后，分為對照（Con）組和高糖（HG）組。其中Con組細胞用含5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液干預(yù)24 h，HG組細胞用含25.0 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液干預(yù)24 h［7］。培養(yǎng)后，棄培養(yǎng)液，收集細胞，用RNA抽提試劑盒提取細胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，行PCR擴增。引物序列：CASC9正向5'-AGAT‐GAAGCCGGTACCTCAGAT-3'，反向5'-TCACTTTA‐AAGAGGGAGAGGAG-3'；miR-513a-5p正向5'-GCGCGTTCACAGGGAGG-3'，反向5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'；GAPDH正向5'-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3'，反向5'-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3'；U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。2?ΔΔCt法計算CASC9相對GAPDH、miR-513a-5p相對U6的表達量。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染和分組處理 取6孔板接種HK-2細胞（5.0×105個/孔），培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，用Lipo‐fectamineTM2000脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染pcDNA-CASC9、pcDNA、anti-miR-513a-5p、anti-miR-NC、共轉(zhuǎn)染pc-DNA-CASC9與miR-NC、pcDNA-CASC9與miR-513a-5p mimics。轉(zhuǎn)染12 h后，RT-qPCR法檢測CASC9或miR-513a-5p表達驗證轉(zhuǎn)染效果。將轉(zhuǎn)染后的各細胞重新接種至6孔板中（5.0×105個/孔），培養(yǎng)12 h后，均用含25 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液干預(yù)24 h，分別記為HG+pcDNA-CASC9組、HG+pcDNA組、HG+anti-miR-513a-5p組、HG+anti-miR-NC組、HG+pcDNACASC9+miR-NC組、HG+pcDNA-CASC9+miR-513a-5p組。培養(yǎng)后，收集各組細胞培養(yǎng)上清和細胞用于后續(xù)指標檢測。

1.2.4 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-α水平 將收集的各組細胞培養(yǎng)上清3 500 r/min離心5 min，保留上清。按照IL-6和TNF-α試劑盒說明書檢測上清中IL-6和TNF-α水平。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將收集的各組細胞密度調(diào)整為1.0×106個/ml，取1.0 ml細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加500μl結(jié)合緩沖液，混懸細胞。依次加10μl Annexin V-FITC和5μl PI，室溫避光孵育15 min后，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 Western blot檢測cleaved-caspase3和cleavedcaspase9蛋白表達 用RIPA試劑提取各組細胞中總蛋白，二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒測定蛋白含量，行10%SDS-PAGE電泳。將分離蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，并用5%脫脂奶粉封閉2 h。于4℃冰箱中分別用cleaved-caspase3（1∶500）、cleaved-caspase9（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）一抗孵育過夜，洗膜后，再于37℃搖床中用山羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育1 h。加化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影，曝光拍照，Image J軟件分析cleaved-caspase3、cleaved-caspase9相對GAPDH的表達量。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?由上海生工根據(jù)LncBase Predicted v.2靶基因預(yù)測的CASC9與miR-513a-5p的結(jié)合位點進行擴增，同時將結(jié)合位點突變，均插入載體，分別構(gòu)建CASC9野生型（WTCASC9）和突變型（MUT-CASC9）熒光素酶報告基因載體。取6孔板接種HK-2細胞（5.0×105個/孔），培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CASC9與miR-NC或miR-513a-5p mimic、MUT-CASC9與miR-NC或miR-513a-5p mimic。轉(zhuǎn)染12 h后，棄培養(yǎng)液。加細胞裂解液裂解細胞，將裂解液3 500 r/min離心10 min，取上清，檢測熒光素酶活性，具體操作參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析SPSS22.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CASC9和miR-513a-5p在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞中的表達 與對照組比較，高糖組HK-2細胞中CASC9的表達量減少（P<0.05），而miR-513a-5p的表達量增加（P<0.05），見表1。

表1 高糖對HK-2細胞中CASC9和miR-513a-5p表達的影響（±s，n=3）Tab.1 Effect of high glucose on expressions of CASC9 and miR-513a-5p in HK-2 cells（±s，n=3）

表1 高糖對HK-2細胞中CASC9和miR-513a-5p表達的影響（±s，n=3）Tab.1 Effect of high glucose on expressions of CASC9 and miR-513a-5p in HK-2 cells（±s，n=3）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05.

Groups Con HG t P CASC9 1.00±0.00 0.44±0.031）32.332 0.000 miR-513a-5p 1.00±0.00 2.79±0.241）12.918 0.000

2.2 上調(diào)CASC9對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞損傷的影響 轉(zhuǎn)染pcDNA-CASC9的HK-2細胞中CASC9表達量明顯高于轉(zhuǎn)染pcDNA的HK-2細胞（2.98±0.13vs1.00±0.00，t=26.380，P<0.05），說明上調(diào)CASC9的HK-2細胞構(gòu)建成功。與對照組比較，高糖組HK-2細胞培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-α表達量增加（P<0.05），細胞凋亡率升高（P<0.05），細胞中凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3和cleaved-cas‐pase9的表達量增加（P<0.05）。與HG+pcDNA組比較，HG+pcDNA-CASC9組HK-2細胞培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-α表達量減少（P<0.05），細胞凋亡率降低（P<0.05），細胞中cleaved-caspase3和cleaved-cas‐pase9蛋白表達量減少（P<0.05）。見圖1、表2。

表2 上調(diào)CASC9對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥因子表達的影響（±s，n=3，pg/ml）Tab.2 Effect of up-regulating CASC9 on expressions of inflammatory factors in renal tubular epithelial cells induced by high glucose（±s，n=3，pg/ml）

表2 上調(diào)CASC9對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥因子表達的影響（±s，n=3，pg/ml）Tab.2 Effect of up-regulating CASC9 on expressions of inflammatory factors in renal tubular epithelial cells induced by high glucose（±s，n=3，pg/ml）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with HG+pcDNA group，2）P<0.05.

Groups Con HG HG+pcDNA HG+pcDNA-CASC9 FP IL-6 33.59±3.16 112.57±10.781）117.58±11.49 44.82±4.122）84.769 0.000 TNF-α 24.98±2.53 78.12±6.221）80.67±6.92 33.34±3.112）99.827 0.000

圖1 上調(diào)CASC9對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of up-regulating CASC9 on renal tubular epithelial cell apoptosis induced by high glucose

2.3 CASC9靶向調(diào)控miR-513a-5p的表達Lnc‐Base Predicted v.2靶基因預(yù)測的CASC9與miR-513a-5p的結(jié)合位點見圖2。共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CASC9與miR-513a-5p的HK-2細胞熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CASC9與miR-NC的細胞（P<0.05），而共轉(zhuǎn)染MUT-CASC9與miR-513a-5p的HK-2細胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染MUT-CASC9與miR-NC的細胞比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表3。轉(zhuǎn)染pcDNA-CASC9的HK-2細胞中miR-513a-5p表達量明顯低于轉(zhuǎn)染pcDNA的HK-2細胞（0.52±0.05vs1.00±0.00，t=16.628，P<0.05），說明上調(diào)CASC9抑制HK-2細胞中miR-513a-5p的表達。

表3 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果（±s，n=3）Tab.3 Double luciferase report experiment results（±s，n=3）

表3 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果（±s，n=3）Tab.3 Double luciferase report experiment results（±s，n=3）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-513a-5p t P WT-CASC9 0.99±0.05 0.32±0.031）19.902 0.000 MUT-CASC9 0.98±0.05 0.96±0.04 0.541 0.617

圖2 CASC9與miR-513a-5p互補的核苷酸序列Fig.2 Complementary nucleotide sequence of CASC9 and miR-513a-5p

2.4 下調(diào)miR-513a-5p對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞損傷的影響 轉(zhuǎn)染anti-miR-513a-5p的HK-2細胞中miR-513a-5p表達量明顯低于轉(zhuǎn)染anti-miR-NC的HK-2細胞（0.21±0.03vs1.00±0.00，t=45.611，P<0.05），說明下調(diào)miR-513a-5p的HK-2細胞構(gòu)建成功。與anti-miR-NC組比較，HG+anti-miR-513a-5p組HK-2細胞培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-α表達量減少（P<0.05），細胞凋亡率降低（P<0.05），細胞中凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9的表達量減少（P<0.05）。見圖3、表4。

表4 下調(diào)miR-513a-5p對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥因子表達的影響（±s，n=3，pg/ml）Tab.4 Effect of down-regulating miR-513a-5p on expres?sion of inflammatory factors in renal tubular epithe?lial cells induced by high glucose（±s，n=3，pg/ml）

表4 下調(diào)miR-513a-5p對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥因子表達的影響（±s，n=3，pg/ml）Tab.4 Effect of down-regulating miR-513a-5p on expres?sion of inflammatory factors in renal tubular epithe?lial cells induced by high glucose（±s，n=3，pg/ml）

Note：Compared with HG+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

Groups HG+anti-miR-NC HG+anti-miR-513a-5p t P IL-6 116.02±10.88 51.93±4.821）9.328 0.001 TNF-α 81.44±7.93 43.81±4.231）7.252 0.002

圖3 下調(diào)miR-513a-5p對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of down-regulating miR-513a-5p on renal tubular epithelial cell apoptosis induced by high glucose

2.5 上調(diào)miR-513a-5p表達逆轉(zhuǎn)lncRNA CASC9過表達對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞損傷的作用共轉(zhuǎn)染pcDNA-CASC9與miR-513a-5p mimics的HK-2細胞中miR-513a-5p表達量明顯高于共轉(zhuǎn)染pcDNACASC9與miR-NC的HK-2細胞（2.34±0.21vs1.00±0.00，t=11.052，P<0.05），說明HK-2細胞中miR-513a-5p表達上調(diào)。與HG+pcDNA-CASC9+miR-NC組 比 較，HG+pcDNA-CASC9+miR-513a-5p組HK-2細胞培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-α表達量增加（P<0.05），細胞凋亡率升高（P<0.05），細胞中凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9的表達量增加（P<0.05）。見圖4、表5。

圖4 上調(diào)miR-513a-5p逆轉(zhuǎn)上調(diào)CASC9對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的作用Fig.4 Up-regulating miR-513a-5p reversed effect of upregulating CASC9 on apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by high glucose

表5 上調(diào)miR-513a-5p逆轉(zhuǎn)上調(diào)CASC9對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥因子表達的作用（±s，n=3，pg/ml）Tab.5 Up-regulating miR-513a-5p reversed effect of upregulating CASC9 on expression of inflammatory factors in renal tubular epithelial cells induced by high glucose（±s，n=3，pg/ml）

表5 上調(diào)miR-513a-5p逆轉(zhuǎn)上調(diào)CASC9對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥因子表達的作用（±s，n=3，pg/ml）Tab.5 Up-regulating miR-513a-5p reversed effect of upregulating CASC9 on expression of inflammatory factors in renal tubular epithelial cells induced by high glucose（±s，n=3，pg/ml）

Note：Compared with HG+pcDNA-CASC9+miR-NC group，1）P<0.05.

Groups HG+pcDNA-CASC9+miR-NC HG+pcDNA-CASC9+miR-513a-5p t P IL-6 42.56±4.24 89.94±6.881）10.155 0.000 TNF-α 32.38±3.19 68.57±5.011）10.554 0.000

3 討論

近年來，隨著居民生活水平的提高及生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率逐年升高［8］。糖尿病腎病作為糖尿病的常見并發(fā)癥，其發(fā)病率也隨著糖尿病患者增加而升高。長期高血糖是糖尿病腎病的主要誘因，其可造成腎小管上皮細胞過度炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細胞凋亡或壞死，導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展［9］。本研究結(jié)果顯示，人腎小管上皮細胞HK-2經(jīng)高糖刺激后，炎癥因子IL-6和TNF-α的分泌量增加，且細胞凋亡率升高，與文獻［10］報道結(jié)果一致，說明高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞損傷模型建立成功。

lncRNA在真核生物中廣泛存在，其可靶向miRNA調(diào)控miRNA靶基因的表達，進而參與調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等生理或病理過程［11］。研究顯示，GAS5、MALAT1和SNHG7等多種lncRNA參與高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞損傷，可作為糖尿病腎病治療的分子靶點［12-14］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)高糖處理的HK-2細胞中CASC9的表達量明顯減少，提示CASC9可能參與高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞損傷；通過上調(diào)HK-2細胞中CASC9的表達發(fā)現(xiàn)，上調(diào)CASC9可阻礙高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞分泌IL-6和TNF-α炎癥因子，并減少細胞凋亡，說明CASC9可保護高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞損傷，其有可能成為糖尿病腎病治療的分子靶標。Caspase級聯(lián)反應(yīng)參與調(diào)控細胞凋亡，其中caspase9是caspase級聯(lián)反應(yīng)的起始分子，其被活化后生成cleaved-cas‐pase9；cleaved-caspase9進一步激活caspase3，生成cleaved-caspase3，剪切細胞內(nèi)各種底物，誘導(dǎo)細胞凋亡［15］。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)CASC9抑制了高糖誘導(dǎo) 的HK-2細 胞中cleaved-caspase9和cleaved-cas‐pase3的蛋白表達水平，提示CASC9可能通過抑制caspase級聯(lián)反應(yīng)來減少高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡。

為了進一步探究CASC9影響高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞炎癥因子分泌和細胞凋亡的分子機制，本研究證實了CASC9可靶向結(jié)合miR-513a-5p，且上調(diào)CASC9抑制HK-2細胞中miR-513a-5p的表達，這與本文HK-2細胞經(jīng)高糖處理后CASC9表達降低而miR-513a-5p表達升高的結(jié)果一致。研究顯示，miR-513a-5p可 以通過下調(diào)XIAP，從而 抑 制TNF-α和LPS誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡［16］。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)miR-513a-5p可抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞分泌IL-6和TNF-α，并減少細胞凋亡，提示下調(diào)miR-513a-5p有可能起到治療腎小管上皮細胞損傷的作用。此外，上調(diào)miR-513a-5p逆轉(zhuǎn)了上調(diào)CASC9對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞IL-6和TNF-α分泌及細胞凋亡的抑制作用，進一步提示CASC9可能通過靶向miR-513a-5p抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞炎癥損傷和凋亡，但其具體調(diào)控的miR-513a-5p的靶基因還有待進一步探究。

綜上，高糖可抑制腎小管上皮細胞中CASC9的表達，而促進miR-513a-5p表達；上調(diào)CASC9可能通過靶向下調(diào)miR-513a-5p阻礙高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細胞HK-2分泌炎癥因子及細胞凋亡，CASC9/miR-513a-5p軸可能為糖尿病腎病的治療提供了潛在分子靶點。