張 坤 殷淑君 張 延 鄭權友（解放軍第305醫(yī)院泌尿外科，北京 100017）

腎移植是治愈終末期腎?。╡nd-stage renal dis‐eases，ESRD）的唯一手段。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人口老齡化問題日益突出，我國ESRD患者人數(shù)不斷攀升，而可移植的腎臟十分有限；此外，腎移植也面臨很多關鍵問題尚未完全解決，特別是移植后腎功能的恢復及移植腎臟的長期存活。在腎臟移植過程中，缺血/再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，I/RI）不可避免，將誘發(fā)急性腎損傷（acute kidney injury，AKI），增加移植物功能延遲恢復的風險，引發(fā)供體腎臟排斥反應，并最終導致移植腎功能喪失。因此，迫切需要明確缺血/再灌注腎損傷（isch‐emia reperfusion induced acute kidney injury，I/R-AKI）的發(fā)病機制，以便更好地保護移植腎功能。

多種因素參與I/R-AKI病理損傷過程，如缺氧，代謝應激，細胞死亡及氧自由基大量釋放等。近年研究表明，免疫炎癥反應在I/R-AKI病理生理過程中扮演重要角色，即“No inflammation，no I/R-AKI”。補體是天然免疫的重要組分，在清除病原微生物及調(diào)節(jié)免疫炎癥反應過程中起著重要作用［1］。補體系統(tǒng)激活主要通過三種途徑（經(jīng)典途徑、旁路途徑和凝集素途徑），并匯聚到C3和C5裂解，產(chǎn)生多種活性產(chǎn)物，最終組裝為膜攻擊復合物，介導細胞損傷并調(diào)節(jié)免疫炎癥反應［2］。C5作為補體系統(tǒng)激活的樞紐分子，活化后裂解為C5a和C5b，C5a與靶細胞表面的C5aR結(jié)合發(fā)揮促炎、免疫調(diào)節(jié)等作用［2-3］。已有研究表明補體C5a/C5aR通路在腎間質(zhì)纖維化及腎盂腎炎病理過程中發(fā)揮重要作用［4-6］。然而，補體C5a/C5aR通路介導I/R-AKI的作用及機制尚不明確。

中性粒細胞來源于骨髓的造血干細胞，是天然免疫系統(tǒng)的重要效應細胞，它吞噬病原體和顆粒，產(chǎn)生活性氧和活性氮，并釋放抗菌肽。近年來的研究表明中性粒細胞在促進I/R-AKI病理過程中發(fā)揮重要的作用：在缺血后小鼠腎臟和早期AKI患者的活檢標本中均檢測到大量中性粒細胞浸潤［7-8］；中性粒細胞來源活性蛋白PAD4促進I/R-AKI［9］；此外，研究發(fā)現(xiàn)抑制中性粒細胞活化因子分泌及向炎癥部位趨化顯著緩解I/R-AKI程度［10-11］。因此，研究中性粒細胞浸潤及活化機制，探索可能的潛在治療靶點具有十分重要的意義。然而，補體C5a/C5aR通路是否參與調(diào)節(jié)中性粒細胞浸潤介導I/R-AKI尚不明確。本研究擬通過建立體內(nèi)及體外I/R-AKI模型，探討補體C5a/C5aR在I/R-AKI中的重要作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物60只雄性野生型小鼠，8~10周齡，20只同齡雄性C5aR基因敲除小鼠購自美國Jackson Mice，飼養(yǎng)于SPF級層流動物房，自由進食和飲水。

1.1.2 實驗試劑及儀器C5aR、KIM-1及LY6G抗體（英國Abcam公司）；Ccap3及Cyt C（美國Santa Cruz公司）；人近曲腎小管上皮細胞系HK-2細胞（中國科學院昆明細胞庫）；TRIzol RNA提取試劑盒（美國Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）；實時熒光定量PCR試劑盒（美國Thermo公司）；C5a ELISA檢測試劑盒（美國BD公司）；伊紅染色液、蘇木素染色液（上海碧云天生物技術有限公司）；HRP標記山羊抗小鼠多克隆抗體、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術公司）；Dylight-594熒光標記二抗、Dylight-488熒光標記二抗（美國Bioleg‐end公司）；DAPI（上海碧云天生物技術有限公司）；PCR所需引物序列（上海生工生物工程股份有限公司）；顯微鏡（Olympus）；全自動生化分析儀（Dimen‐sion RXL Max）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組與建模40只野生型小鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組、缺血20 min組、缺血30 min組、缺血40 min組，每組10只，再灌注24 h后取血及腎組織；剩余20只野生型小鼠和20只C5aR基因敲除小鼠進一步分為假手術組和缺血40 min組，每組各10只，再灌注24 h后取血及腎組織。采用夾閉雙側(cè)腎蒂的方法建立小鼠I/R-AKI模型［12］。首先腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg），麻醉后仰臥在37℃恒溫手術臺上，腹部備皮、消毒、鋪無菌洞巾，沿腹部正中切口1 cm，分離左右腎蒂。假手術組不夾閉腎蒂，手術組用無損傷微動脈夾夾閉腎蒂，根據(jù)不同分組確定夾閉時間，恢復血流后，觀察腎臟顏色由暗黑色恢復紅色表明造模成功，逐層關腹，術后腹腔注射溫生理鹽水促進復蘇。待小鼠蘇醒后，放入鼠籠中正常進食進水。

1.2.2 人腎小管上皮細胞系HK-2的處理HK-2細胞2×105個/ml接種于6孔板或放置細胞玻片于12孔板中，輕輕搖晃混勻后于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長至約70%時，根據(jù)不同缺氧時間放入低氧箱（1%O2）中培養(yǎng)（6 h、12 h或24 h）后，棄上清并加入新鮮培養(yǎng)液混勻，放入37℃、21%O2、5%CO2培養(yǎng)箱，再行供氧培養(yǎng)6 h用于后續(xù)實驗。

1.2.3 腎組織HE染色 腎組織標本經(jīng)4%多聚甲醛固定后制成石蠟標本并切片（4 μm）。石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化后，伊紅染色2 min，蒸餾水充分洗滌后，蘇木素染色1 min，自來水沖洗返藍，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并采集圖像。采用雙盲法進行腎損傷的半定量評價：在顯微鏡下觀察皮髓質(zhì)交界處腎小管上皮的損傷情況，每個腎臟在100倍光鏡下至少選取5個視野，半定量評價分為7個等級（0級為無損傷；0<1級≤15%損傷；15%<2級≤30%損傷；30%<3級≤45%損傷；45%<4級≤60%損傷；60%<5級≤75%損傷；6級>75%損傷）。

1.2.4 血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cre）測定 血清BUN、Cre值采用全自動生化分析儀測定。

1.2.5 IHC檢 測C5aR、KIM-1、Ccap3和Cyt C表達 石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、洗滌，微波修復抗原，3%H2O2去除組織中的內(nèi)源性過氧化物酶，以5%BSA常溫封閉30 min，加入抗C5aR（1∶200）、KIM-1（1∶400）、Ccap3（1∶200）和Cyt C（1∶200）抗體。4℃孵育過夜后，PBS洗滌，再以辣根過氧化物酶標記的二抗常溫孵育1 h，經(jīng)洗滌、DAB顯色、蘇木精復染、自來水返藍、脫水、封片等步驟，最后于Olympus光學正置顯微鏡下觀察并采集圖像。圖像采集后，通過Image J軟件對各組圖像染色面積進行半定量分析。

1.2.6 ELISA檢測血清中C5a的水平 采用C5a ELISA檢測試劑盒，按照說明書步驟測定小鼠血清中的C5a水平。

1.2.7 IF檢測HK-2細胞C5aR表達 經(jīng)缺氧再供氧培養(yǎng)處理的HK-2細胞玻片經(jīng)PBS清洗，4%多聚甲醛固定，5%BSA常溫封閉30 min，孵育抗C5aR（1∶200）抗體。4℃過夜后，PBS清洗，再以Dylight-594熒光標記的二抗常溫孵育30 min，經(jīng)洗滌、DAPI復染5 min，熒光抗淬滅劑封片后在Olympus熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.8 Western blot檢測HK-2細胞C5aR表達 缺氧再供氧培養(yǎng)處理HK-2細胞加入蛋白裂解液進行冰上裂解30 min，低溫離心并檢測蛋白濃度。取50μg變性蛋白樣品加入SDS-PAGE中進行電泳，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、漂洗、封閉，孵育一抗C5aR（1∶200）4℃過夜，再經(jīng)過復溫、漂洗，相應二抗室溫孵育1 h，采用化學發(fā)光法上機檢測。灰度值統(tǒng)計采用Image J軟件進行半定量。

1.2.9 RT-PCR檢測C5aR、KIM-1、CXCL2、MIP-1α和CXCR2的mRNA表達 取腎組織標本加液氮研磨后加入Trizol，依據(jù)試劑盒說明書提取總RNA。采用紫外分光光度計測量濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用實時定量PCR法（ABSTEPONE）檢測C5aR、KIM-1、CXCL2、MIP-1α和CXCR2的mRNA表達水平，以GAPDH作為內(nèi)參，各樣本的C值按公式2?ΔΔCt計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.10 IF檢測腎組織中性粒細胞浸潤情況 腎組織冰凍切片（6 μm）后，丙酮固定20 min，PBS洗滌，0.3%TritonX-100通透15 min，PBS洗滌，5%BSA封閉1 h，孵育一抗LY6G抗體（1∶100），4℃避光過夜，經(jīng)復溫、洗滌，孵育Dylight-488熒光標記的二抗1 h，經(jīng)洗滌、DAPI復染核，再次洗滌、封片后在熒光顯微鏡下觀察實驗結(jié)果，并采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較采用非配對t檢驗，兩連續(xù)變量的相關性采用Pearson相關性分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠I/R-AKI動物模型制備 為確保小鼠I/RAKI動物模型制備成功，實驗組在37℃恒溫條件下微血管夾同時夾閉雙側(cè)腎動脈；假手術組只打開腹腔，不夾閉腎動脈，可見腎臟呈鮮紅色（圖1A）。夾閉腎動脈后，腎臟顏色變?yōu)楹谏▓D1B），表明血管完全阻斷；取出血管夾，腎臟再灌注后顏色逐漸轉(zhuǎn)為紅色（圖1C），表明血供恢復。

圖1 小鼠I/R前后腎臟顏色改變Fig.1 Color changes in progress of renal I/R in mice

2.2 小鼠不同缺血時間腎臟損傷比較和補體C5a、C5aR的表達情況 檢測不同缺血時間腎臟病理損傷情況及補體C5a/C5aR表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著缺血時間延長，腎臟病理損傷逐漸加重，補體C5aR表達逐漸增強，且C5aR表達與腎損傷程度呈正相關（圖2）。相應地，隨缺血時間延長，BUN、Cre及C5a升高，且C5a與BUN及Cre之間具有顯著正相關（圖3）。以上結(jié)果表明，補體C5a/C5aR通路在小鼠I/R-AKI病理過程中發(fā)揮重要作用。

圖2 小鼠不同缺血時間腎組織的病理改變和補體C5aR表達變化Fig.2 Histological changes and C5aR expression in renal tissues at different ischemic time points

圖3 小鼠不同缺血時間血清BUN、Cre和C5a水平Fig.3 Serum BUN，Cre and C5a levels in mice at different ischemic time points

2.3 HK-2細胞不同缺氧時間補體C5aR表達 采用HK-2細胞在體外模擬腎小管上皮細胞缺氧再供氧過程，不同缺氧時間條件下檢測補體C5aR表達變化（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著缺氧時間延長，補體C5aR表達逐漸增強，體外進一步證實補體C5aR參與缺氧再供氧引起的腎損傷過程。

圖4 HK-2細胞不同缺氧時間補體C5aR表達變化Fig.4 Expression of C5aR in HK-2 cells at different ischemic time points

2.4 C5aR基因敲除后小鼠腎臟損傷情況 建立野生型及C5aR基因敲除小鼠I/R-AKI模型，比較兩組小鼠的腎功能及腎臟病理損傷等情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C5aR基因敲除小鼠相較于野生型小鼠BUN、Cre水平及腎臟病理損傷程度顯著降低（圖5）。同時檢測各組小鼠腎損傷分子（KIM-1）及細胞凋亡蛋白（Ccap3和Cyt C）表達，發(fā)現(xiàn)C5aR基因敲除后上述指標表達顯著下調(diào)（圖6）。由此可知，C5aR基因敲除能顯著減輕I/R-AKI。

圖5 C5aR基因敲除對I/R后BUN、Cre及腎組織病理損傷的影響Fig.5 Effect of C5aR gene knockout on BUN，Cre and histologic changes of renal tissues after I/R

圖6 C5aR基因敲除對I/R后腎組織KIM-1、Ccap3和Cyt C的影響Fig.6 Effect of C5aR gene knockout on expressions of KIM-1，Ccap3 and Cyt C in renal tissues after I/R

2.5 各組小鼠腎組織中性粒細胞浸潤 檢測I/R前后小鼠腎組織趨化因子CXCL2、MIP-1α和CXCR2的表達及中性粒細胞浸潤情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，I/R后中性粒細胞浸潤相關趨化因子CXCL2、MIP-1α和CXCR2表達水平顯著升高，中性粒細胞向腎組織大量遷移，而C5aR基因敲除后上述趨化因子水平及中性粒細胞的浸潤較野生型小鼠明顯降低（圖7），表明補體C5a/C5aR通路可能通過促中性粒細胞浸潤介導I/R-AKI病理過程。

圖7 C5aR基 因 敲 除 對I/R后 腎 組 織CXCL2、MIP-1和CXCR2的表達及中性粒細胞浸潤的影響Fig.7 Effect of C5aR gene knockout on expressions of CXCL2，MIP-1 and CXCR2 in renal tissues and infiltration of neutrophils after I/R

3 討論

腎移植過程中I/R損傷不可避免，可誘發(fā)急性腎損傷、移植物功能延遲恢復、排斥反應等，并最終導致移植腎功能喪失，但其機制尚未完全明確。本研究利用小鼠夾閉雙側(cè)腎蒂的方式構(gòu)建動物模型，發(fā)現(xiàn)I/R后的補體C5a及C5aR的表達水平隨著缺血時間的延長而明顯增高，且與腎臟的損傷程度呈正相關。相應地，在體外利用人腎小管上皮細胞系（HK-2）上模擬細胞缺氧再供氧過程，發(fā)現(xiàn)C5aR表達隨著缺氧時間的延長而明顯上調(diào)。上述結(jié)果表明，補體C5a/C5aR可能在I/R-AKI病理過程中發(fā)揮重要作用。更重要的是，在補體C5aR基因敲除后，腎組織的病理損傷、BUN、Cre、KIM-1和細胞凋亡水平均明顯降低，由此推斷補體C5a/C5aR促進I/R-AKI病理過程。

免疫炎癥反應介導I/RI，中性粒細胞浸潤是加劇該病理過程的重要事件。有研究顯示在肝I/R中發(fā)現(xiàn)大量嗜中性粒細胞募集到肝臟，細胞因子、趨化因子大量活化［13］。REID等［14］在腎的I/RI研究中發(fā)現(xiàn)I/R 6 h后，血液和腎臟中活化的中性粒細胞開始增加，I/R 24 h后，血液和腎臟中的絕對中性粒細胞計數(shù)顯著增加，I/R 48 h后，腎臟中的中性粒細胞仍保持升高。相似地，本研究發(fā)現(xiàn)I/R 24 h后，大量的中性粒細胞向腎臟募集。那么在腎I/R過程中，中性粒細胞的募集是否受到補體C5a/C5aR的調(diào)控？有研究發(fā)現(xiàn)C5a是粒細胞的有效化學引誘物，C5aR缺乏的小鼠對粒細胞募集具有抗性［15］。另有研究發(fā)現(xiàn)補體C5aR能介導中性粒細胞的活化和擴增，加重ANCA引起的壞死性新月體腎小球腎炎［16］。本研究中C5aR基因敲除小鼠中性粒細胞的浸潤相對野生組明顯減少，證實了補體C5aR能調(diào)節(jié)中性粒細胞的募集，加劇缺血性損傷。有研究顯示，CXCL2、MIP-1α和CXCR2等趨化因子在中性粒細胞的募集和激活中發(fā)揮關鍵作用［17］。本研究發(fā)現(xiàn)I/R 24 h后，CXCL2、MIP-1α和CXCR2等趨化因子表達顯著升高，C5aR基因敲除小鼠相較野生型小鼠明顯降低，證實了C5aR可能通過調(diào)節(jié)CXCL2、MIP-1α和CXCR2等趨化因子的表達，誘使中性粒細胞募集到腎組織中并激活，加重腎臟損傷。有研究證實抑制P38-MAPK信號通路能減輕腎I/R損傷，而補體系統(tǒng)能顯著激活P38-MAPK信號通路［18］。由此，推斷C5a/C5aR可能通過P38-MAPK信號通路促進中性粒細胞浸潤介導I/R-AKI，有待下一步研究證實。

此外，有大量的研究通過抑制補體活性成分來改善器官的I/RI。有研究利用一種合成的siRNA抑制C3的信使RNA，從而抑制補體激活并預防IRI［19］。還有研究利用抑制全部或部分補體系統(tǒng)的藥物來進行干預，如可溶性補體受體1型（sCR1），C1抑制劑（C1-INH）已被證明可以減少各種器官的I/R損傷［20］。因此，開發(fā)針對補體C5aR的抑制劑來減少I/RI具有重要研究意義和臨床應用價值。

本研究還存在許多不足之處，如：缺乏對中性粒細胞功能的研究；缺乏對中性粒細胞與腎損傷之間進一步分子機制研究；所選文獻資料有限，缺乏相關臨床研究成果等；下一步將針對這些不足之處進行更深入的研究探討。