吳文哲 付長(zhǎng)秀 黃李晨露 鄭永欽 賀軍棟（昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650000）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，其特征是關(guān)節(jié)軟骨逐漸破壞，進(jìn)而產(chǎn)生繼發(fā)性滑膜炎癥，軟骨下骨破壞［1-2］。OA的病理靶點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨，因此，研究關(guān)節(jié)軟骨對(duì)其治療具有重要意義。

正常關(guān)節(jié)軟骨主要由Ⅱ型膠原蛋白α1（CoL2A1）和蛋白聚糖（Aggrecan）組成，OA的主要特征是軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的軟骨降解酶-基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）上調(diào)，如MMP-1、MMP-3、MMP-13和ADAMTS金屬蛋白酶等，它們可降解CoL2A1、Aggrecan［3］。其關(guān)鍵誘導(dǎo)因子IL-1和TNF-α可刺激軟骨降解酶合成，IL-6可使炎癥反應(yīng)加重［4-5］。OA中活性氧和活性氮的增加也會(huì)通過(guò)DNA損傷誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞過(guò)早衰老。一氧化氮（NO）通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)軟骨降解，如抑制軟骨基質(zhì)大分子（如膠原蛋白和蛋白聚糖）合成、增加其他氧化劑（如H2O2）、增強(qiáng)MMP的產(chǎn)生及包括PGE2在內(nèi)的炎癥細(xì)胞因子，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6-7］。正常情況下，NF-κB二聚體與IκB蛋白的相互作用存在于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞受到刺激后，IκB被IκB激酶（IKKs）磷酸化并被蛋白酶體降解，因此NF-κB二聚體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，與NF-κB反應(yīng)元件結(jié)合，激活數(shù)百種免疫調(diào)節(jié)蛋白、促炎細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子和生長(zhǎng)因子表達(dá)［8-9］。NF-κB的激活包括經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑，經(jīng)典途徑涉及由p65、c-Rel和p50亞基組成的NF-κB二聚體及IKK復(fù)合物（IKKα/β/γ）通路，該通路具有快速、可逆特點(diǎn)；而非典型通路主要通過(guò)IKKα激活p52和RelB，非經(jīng)典途徑NF-κB激活速度慢，且持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。NF-κB由促炎信號(hào)或參與發(fā)育的因子激活，基因敲除研究發(fā)現(xiàn)，典型的p65/p50復(fù)合物對(duì)胚胎發(fā)育和免疫系統(tǒng)功能至關(guān)重要，p65蛋白磷酸化后從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，說(shuō)明NF-κB信號(hào)通路被激活［10］。

外泌體是多囊體與質(zhì)膜融合時(shí)，通過(guò)胞吐作用釋放到細(xì)胞外環(huán)境的一種囊泡。外泌體可促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抑制纖維化、促進(jìn)血管生成等［11］。近期研究顯示，間充質(zhì)外泌體可通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子及相關(guān)基因表達(dá)促進(jìn)膠原蛋白表達(dá)及軟骨細(xì)胞的增殖、分化。盡管已經(jīng)有很多關(guān)于干細(xì)胞外泌體的研究，但外泌體在OA中的作用機(jī)制尚不明確。本研究分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體，通過(guò)與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，研究外泌體是否通過(guò)NF-κB信號(hào)通路對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 臍帶來(lái)源于云南省第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科2019年7月至2020年12月收治的剖宮產(chǎn)患者，試驗(yàn)經(jīng)云南省第一人民醫(yī)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或法定代表人簽署知情同意書(shū)；原代大鼠軟骨細(xì)胞購(gòu)于上海通派細(xì)胞庫(kù)；外泌體提取試劑盒購(gòu)于SBI公司；CCK-8試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑A、B液購(gòu)于MCE公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、LPS、大鼠TNF-α、IL-6、PEG2 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于索萊寶公司；大鼠NO ELISA檢測(cè)試劑盒、TSG101一抗、CD63購(gòu)于Abcam公司；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于天根公司；兔二抗、兔熒光二抗、Aggrecan-1一抗、CoL2A一抗、p65一抗、p-p65一抗、CD9一抗購(gòu)于CST公司；PKH26紅色熒光染料試劑盒購(gòu)于Sigma公司；GAPDH購(gòu)于Elabscience公司；鼠二抗MMP-13購(gòu)于Proteintech公司；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)于TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的提取、培養(yǎng)與鑒定 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提?。簩⒛殠蕹埽睇}水清洗，剪成0.5~1 cm2的組織塊鋪于T72瓶中，加入含10%胎牛血清、1%鏈霉素-青霉素、89%DMEM的完全培養(yǎng)基中。每隔3 d觀察細(xì)胞爬出情況。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)鑒定：通過(guò)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基、干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基AB液、干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞分化，分別用茜素紅、油紅O、阿利新藍(lán)染色，顯微鏡下觀察。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)鑒定：當(dāng)干細(xì)胞融合度達(dá)到85%左右時(shí)，胰酶消化，1 000 r/min離心10 min，PBS清洗2遍，重懸，2 000 r/min離心6 min，將細(xì)胞以至少1×105個(gè)/管轉(zhuǎn)移至流式管，加入1 μl抗體，4℃避光孵育30 min后上機(jī)檢測(cè)。

大鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)：大鼠軟骨細(xì)胞采用含10%胎牛血清、1%鏈霉素-青霉素、89%DMEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 外泌體的提取與鑒定 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞密度為80%左右時(shí)，收取上清，3 000 g離心15 min以去除死細(xì)胞及細(xì)胞碎片，吸取上清于新離心管中，通過(guò)外泌體提取試劑盒提取外泌體，每5 ml培養(yǎng)上清加入1 ml exoQuick-TC Exosome沉淀液，翻轉(zhuǎn)混合均勻，4℃過(guò)夜后，3 000 g、4℃離心10 min，離心管底部可見(jiàn)乳白色外泌體沉淀，棄上清，用30~1 00μl的buffer B重懸外泌體。透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，納米流式儀進(jìn)行外泌體NTA粒徑分析，BCA比色法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，取10 μg蛋白煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%奶粉封閉非特異性蛋白，加入目的一抗4℃孵育過(guò)夜后，加入對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒進(jìn)行發(fā)光成像。

1.2.3 軟骨細(xì)胞損傷模型的建立 以LPS構(gòu)建大鼠軟骨細(xì)胞關(guān)節(jié)炎模型，軟骨細(xì)胞長(zhǎng)至80%密度時(shí)鋪于96孔板，每孔約4 000個(gè)細(xì)胞、100 μl細(xì)胞懸液，24 h后以含0、20、40、80 ng/ml LPS的完全培養(yǎng)基處理軟骨細(xì)胞24 h，CCK-8檢測(cè)軟骨細(xì)胞活力，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)LPS濃度為40 ng/ml時(shí)，細(xì)胞增殖最慢。因此選取40 ng/ml LPS構(gòu)建細(xì)胞模型。

實(shí)驗(yàn)分為軟骨細(xì)胞組（Control組）、軟骨細(xì)胞+40 ng/ml LPS組（LPS組）、軟骨細(xì)胞+40 ng/ml LPS+10μg/ml外泌體組（LPS+Exo組）。LPS組處理方法：加入LPS處理24 h后更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；LPS+Exo組 處 理 方 法：LPS處 理24 h后 更 換 含 有10μg/ml外泌體的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。倒置顯微鏡下觀察三組形態(tài)變化。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn) 為確定外泌體是否進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用，取5μl外泌體與500μl稀釋液C混勻，同時(shí)取2μl PKH26熒光染液與500μl稀釋液C混勻，混勻兩管液體，室溫孵育5 min，加1 ml胎牛血清終止反應(yīng)，室溫孵育1 min后，3 000 g離心10 min，棄上清，以5 ml完全培養(yǎng)基重懸沉淀，重復(fù)離心2次后（除去未結(jié)合的染料），5 ml完全培養(yǎng)基重懸，取1 ml加入LPS處理的OA細(xì)胞，2 h后加入DAPI，激光共聚焦顯微鏡下采用油鏡觀察外泌體是否被細(xì)胞攝取。

1.2.5 細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡水平。細(xì)胞長(zhǎng)至80%以上后，胰酶消化，收集約1×107個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌，1×Binding buffer懸浮細(xì)胞，300 g離心10 min，棄上清；1×Binding buffer再次懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞密度達(dá)到1×106個(gè)/ml；每管加入100 μl細(xì)胞懸液，進(jìn)行FITC、PI染色后，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，比較三組細(xì)胞凋亡程度。

1.2.6 炎癥相關(guān)因子表達(dá)檢測(cè) 收集各組細(xì)胞上清液，按照TNF-α、IL-6、PEG2、NO檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算為T(mén)NF-α、IL-6、PEG2、NO 4種炎癥因子表達(dá)水平。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用RNA提取試劑盒提取收集三組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)程序：95℃5 s；60℃30 s。共40個(gè)循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算MMP-13、CoL2A1、GAPDH mRNA表達(dá)。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 基因引物序列Tab.1 Gene primer sequences

1.2.8 Western blot收集三組細(xì)胞，以含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心獲得含有蛋白的上清，BCA比色法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，取10μg蛋白煮沸變性后，行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%奶粉封閉非特異性蛋白，加入目的一抗4℃孵育過(guò)夜后，TBST洗滌3次，每次5 min，加入對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h，使用ECL化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒進(jìn)行發(fā)光成像。

1.2.9 細(xì)胞免疫熒光 在共聚焦小室中培養(yǎng)三組細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌，取1 ml 4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，預(yù)冷PBS洗滌后，采用Triton-100室溫通透30 min，預(yù)冷PBS洗滌，然后以2%的BSA于37℃封閉1 h，預(yù)冷PBS洗滌。加入p65一抗（1∶400）4℃過(guò)夜，預(yù)冷PBS洗滌，加入熒光兔二抗（1∶500）室溫孵育1 h，PBS洗滌后加入DAPI，1 min后于共聚焦顯微鏡下觀察蛋白入核情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為±s，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。使用Image、SPSS和GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行圖像分析、數(shù)據(jù)采集，作圖分析組間差異性，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取與鑒定 倒置顯微鏡下觀察到原代細(xì)胞以梭形、紡錘形為主，周?chē)卸嘟切?、圓形等，P3代為長(zhǎng)梭形，且細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定（圖1A）。成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)3周左右，油紅O染色顯示大量脂滴沉淀；經(jīng)茜素紅染色后，出現(xiàn)大量鈣沉積；阿利新藍(lán)染色后，軟骨組織中有內(nèi)酸性黏多糖出現(xiàn)（圖1B）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD90、CD73和CD105抗體的陽(yáng)性表達(dá)率分別為99.86%、99.61%和99.71%，HLA-DR、CD45、CD34抗體的陽(yáng)性表達(dá)率分別為0.31%、0.32%、0.34%（圖1C），與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)一致。以上結(jié)果表明成功分離提取出臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

圖1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定Fig.1 Culture and identification of umbilical cord mesen?chymal stem cells

2.2 外泌體的提取與鑒定 透射電鏡下觀察提取物外泌體呈周?chē)蛊鹬行陌枷莸谋袪睿▓D2A），直徑30~200 nm，與外泌體粒徑一致（圖2B），含有CD9、TSG101、CD63三種標(biāo)志蛋白（圖2C）。以上結(jié)果表明提取物為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體，外泌體蛋白含量為1.7~2.0 mg/ml。

圖2 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的提取與鑒定Fig.2 Extraction and identification of umbilical cord mes?enchymal stem cells exosomes

2.3 OA模型建立，外泌體被OA細(xì)胞內(nèi)化 如圖3所示，與Control組相比，LPS組加入40 ng/ml LPS處理24 h后，部分細(xì)胞發(fā)生凋亡，活細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)變圓，細(xì)胞核變大；LPS+Exo組加入外泌體處理后細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞形態(tài)向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變。外泌體與OA軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后，共聚焦顯微鏡下觀察到外泌體已經(jīng)被細(xì)胞內(nèi)化，外泌體富集在胞核附近。

圖3 OA模型建立、外泌體與細(xì)胞共培養(yǎng)Fig.3 Model establishment of OA and co-culture of exosomes and cells

2.4 外泌體對(duì)OA軟骨細(xì)胞凋亡水平的影響 與Control組相比，LPS組細(xì)胞凋亡率顯著提高（P<0.001）；與LPS組相比，LPS+Exo組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.001，表2、圖4）。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡Fig.4 Flow cytometry to detect chondrocyte apoptosis

表2 各組細(xì)胞凋亡率（±s，%）Tab.2 Apoptosis rate of each group（±s，%）

表2 各組細(xì)胞凋亡率（±s，%）Tab.2 Apoptosis rate of each group（±s，%）

Note：Compared with control group，1）P<0.001；compared with LPS group，2）P<0.001.

Groups Control LPS LPS+Exo Apoptosis rate 10.99±0.89 45.68±0.341）29.97±1.012）

2.5 外泌體對(duì)OA細(xì)胞中相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比，LPS組細(xì)胞中IL-6、TNF-α、NO表達(dá)量均顯著升高（P<0.001或P<0.01）；與LPS組相比，LPS+Exo組細(xì)胞中IL-6、TNF-α、NO表達(dá)量顯著降低（P<0.001或P<0.05）；各組細(xì)胞中PEG2表達(dá)量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表3、圖5）。

圖5 外泌體和骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞共培養(yǎng)后相關(guān)炎癥因子表達(dá)Fig.5 Expressions of related inflammatory factors after co-culture of exosomes and OA cells

表3 各組細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的表達(dá)（±s）Tab.3 Expressions of cell-related inflammatory factors in each group（±s）

表3 各組細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的表達(dá)（±s）Tab.3 Expressions of cell-related inflammatory factors in each group（±s）

Note：Compared with control group，1）P<0.001，2）P<0.01；compared with LPS group，3）P<0.001，4）P<0.05.

Groups Control LPS LPS+Exo TNF-α/（pg·ml?1）33.41±3.65 87.10±1.601）67.72±1.593）NO/（nmol·well?1）0.76±0.06 1.22±0.061）0.99±0.054）IL-6/（pg·ml?1）89.83±20.39 184.88±34.282）105.81±22.904）PGE2/（pg·ml?1）142.88±8.74 137.58±1.28 136.74±2.11

2.6 外泌體對(duì)OA軟骨細(xì)胞軟骨相關(guān)基因表達(dá)的影響qRT-PCR結(jié)果顯示，與Control組相比，LPS組細(xì)胞CoL2A表達(dá)量顯著降低（P<0.01），MMP-13表達(dá)量顯著升高（P<0.01）；與LPS組相比，LPS+Exo組細(xì)胞中CoL2A表達(dá)量顯著升高（P<0.01），MMP-13表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍可見(jiàn)MMP-13表達(dá)有下降趨勢(shì)（P>0.05，表4、圖6A、B）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與LPS組相比，LPS+Exo組關(guān)節(jié)炎細(xì)胞中CoL2A、AGC-1蛋白表達(dá)量顯著升高，MMP-13蛋白表達(dá)量顯著降低（圖6C~F）。

圖6 外泌體和骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞共培養(yǎng)后軟骨生成及降解基因的表達(dá)量Fig.6 Expressions of chondrogenic and degradable genes after co-culture of exosomes and OA cells

表4 各組細(xì)胞軟骨生成及降解基因表達(dá)量（±s）Tab.4 Expressions of chondrogenesis and degradation genes in each group（±s）

表4 各組細(xì)胞軟骨生成及降解基因表達(dá)量（±s）Tab.4 Expressions of chondrogenesis and degradation genes in each group（±s）

Note：Compared with control group，1）P<0.01；compared with LPS group，2）P<0.01.

Group Control LPS LPS+Exo CoL2A 1.00±0.00 0.34±0.091）0.80±0.102）MMP-13 1.00±0.00 2.10±0.101）1.77±0.08

2.7 外泌體對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響 免疫熒光顯示LPS+Exo組細(xì)胞核中p65表達(dá)明顯低于LPS組（圖7A~C）；Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，LPS組中p-p65蛋白表達(dá)量顯著升高（P<0.001），p65蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.001）；與LPS組相比，LPS+Exo組中p-p65蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.01），p65蛋白表達(dá)量顯著升高（P<0.01，表5、圖7D~F）。

圖7 NF-κB信號(hào)通路中p65蛋白的定位與表達(dá)水平Fig.7 Localization and expression level of p65 protein in NF-κB signaling pathway

表5 各組細(xì)胞p-p65、p65蛋白表達(dá)量（±s）Tab.5 Expressions of p-p65 and p65 protein in cells of each group（±s）

表5 各組細(xì)胞p-p65、p65蛋白表達(dá)量（±s）Tab.5 Expressions of p-p65 and p65 protein in cells of each group（±s）

Note：Compared with control group，1）P<0.001；compared with LPS group，2）P<0.01.

Groups Control LPS LPS+Exo p-p65 0.75±0.06 1.69±0.061）1.46±0.032）p65 2.03±0.03 1.56±0.051）1.85±0.062）

3 討論

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體可緩解多種疾病，如移植物抗宿主病、心肌缺血-再灌注損傷和急性腎損傷等。外泌體在體外可促進(jìn)多種細(xì)胞增殖，并抑制其凋亡，在體內(nèi)可促進(jìn)血管生成，抑制多種器官的纖維化進(jìn)展，且具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，有研究發(fā)現(xiàn)外泌體可緩解葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型［12］。本研究首先成功提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)CD73、CD90、CD105，低表達(dá)CD45、CD34、HLR-DR，并成功將其誘導(dǎo)為骨樣細(xì)胞、脂肪樣細(xì)胞和軟骨樣細(xì)胞，以上結(jié)果均符合國(guó)際細(xì)胞療法學(xué)會(huì)制定標(biāo)準(zhǔn)；將成功提取外的泌體進(jìn)行電鏡觀察、NTA粒徑分析、外泌體表達(dá)標(biāo)志物鑒定；本研究發(fā)現(xiàn)外泌體通過(guò)進(jìn)入骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，富集在細(xì)胞核附近，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量發(fā)揮調(diào)控作用。

外泌體可通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子及相關(guān)基因表達(dá)促進(jìn)膠原蛋白生成，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖及分化［13］；此外，在OA模型小鼠中，滑膜衍生的外泌體可上調(diào)軟骨生成基因CoL2A1和聚集蛋白聚糖，下調(diào)MMP-13和Runx2（相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2）［14］。本研究以LPS處理正常軟骨細(xì)胞后，軟骨細(xì)胞凋亡率提高，IL-6、TNF-α、NO表達(dá)量增加，且軟骨生成基因MMP-13表達(dá)增加，降解基因CoL2A表達(dá)量降低，而將外泌體加入OA細(xì)胞模型時(shí)，以上結(jié)果發(fā)生了一定程度的逆轉(zhuǎn)，炎癥因子及氧化應(yīng)激因子表達(dá)被顯著抑制，MMP-13蛋白表達(dá)降低，CoL2A、AGC-1蛋白表達(dá)量升高，且促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，這些結(jié)果表明外泌體對(duì)OA軟骨細(xì)胞具有正向調(diào)控作用。有研究表明骨髓間充質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的外泌體可能通過(guò)抑制PEG2表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞活化，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向抗炎表型分化，從而減少滑膜的炎癥激活，減輕OA鼠骨關(guān)節(jié)炎癥［15］，但本研究中PEG2的表達(dá)在三組實(shí)驗(yàn)中無(wú)明顯差異，可能由于本實(shí)驗(yàn)使用的誘導(dǎo)劑（LPS）與文獻(xiàn)中使用的誘導(dǎo)劑（IL-1β）不同，也可能是由于外泌體來(lái)源不同，導(dǎo)致PEG2表達(dá)不同。

NF-κB是一種可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化及正常和惡性細(xì)胞存活中發(fā)揮核心作用，NF-κB反式激活域包括RelA（P65）、RelB和c-Rel，p65蛋白磷酸化后從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核說(shuō)明NF-κB信號(hào)通路被激活［10，16-17］。NF-κB信號(hào)通路參與許多生物學(xué)過(guò)程，且在多種疾病中失調(diào)。丁酸鈉可通過(guò)GPR43/β-阻滯素-2/NF-κB信號(hào)通路減少炎癥反應(yīng)，從而顯著減輕LPS誘導(dǎo)的肝損傷［18］。本研究發(fā)現(xiàn)LPS處理正常軟骨細(xì)胞后，p65蛋白由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，且p-p65蛋白表達(dá)升高，p65蛋白表達(dá)降低，提示NF-κB信號(hào)通路被激活；加入外泌體后，p65蛋白磷酸化水平受到抑制，并抑制p65蛋白從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)，提示外泌體可能通過(guò)降低NF-κB信號(hào)通路的活化水平調(diào)控OA細(xì)胞。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞免疫反應(yīng)，并可抑制NF-κB信號(hào)通路激活，為緩解OA提供了新思路。但本文只研究了NF-κB通路，對(duì)其他通路的研究尚未開(kāi)展。后期課題組將根據(jù)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行深入研究。