萬強(qiáng)貴 王 婷 田立鵬 李春愛 蔡 夢 蒲陸梅

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

茄病鐮刀菌（Fusarium solani）是一種自然界中分布廣泛的真菌類群，其抗逆性強(qiáng)，寄主生存方式多樣，是一些重要農(nóng)業(yè)植物的宿主特異性病原體。相關(guān)研究表明，F(xiàn)usarium solani能引起黃瓜冠腐病、牡丹根腐病以及豆科和瓜類植物根莖腐爛病等［1-3］，這些病害嚴(yán)重影響了我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，在免疫力低下或免疫力障礙的患者中，F(xiàn)usarium solani還可引發(fā)侵襲性真菌病，嚴(yán)重時可造成生命體死亡［4］。

目前，關(guān)于控制Fusarium solani病害的方法，主要包括物理、化學(xué)、生物防治等。物理和化學(xué)防治是采用各種試劑或紫外線輻射處理等，殺菌效果好，使用方便，但長期使用不僅會增強(qiáng)病原菌抗藥性，而且會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染［5-7］，危害人體健康。生物防治是利用一些具有拮抗作用的菌種進(jìn)行防控，如木霉屬［8］、菌種提取物［9］等，但它們對溫度、濕度等環(huán)境因素要求較高［10］。因此，尋找一種安全高效、無污染、易實(shí)行的處理方法至關(guān)重要。

接觸輝光放電等離子體（contact glow discharge plasma，CGDP）作為一種新興的高級氧化技術(shù)，在材料合成［11］、廢水處理［12］、生物醫(yī)藥［13］等方面取得了廣泛的應(yīng)用。研究也表明，CGDP產(chǎn)生的高能活性粒子對細(xì)菌、真菌和病毒等具有較高的清除率［14］。此外，CGDP還具有操作簡單、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，其生成的強(qiáng)氧化性物質(zhì)·OH和H2O2等，特別適用于食品中毒素的降解以及微生物的滅活［15］，且無二次污染物的生成，是一種更安全、更高效、更環(huán)保的技術(shù)方法。

本研究以Fusarium solani作為目標(biāo)菌株，通過CGDP處理，研究電壓強(qiáng)度、孢子初始濃度、抗壞血酸濃度對殺菌效果的影響，通過菌落生長情況、細(xì)胞膜完整性、孢子形態(tài)、活性粒子（·OH、H2O2、NO3-）濃度、pH值等指標(biāo)分析CGDP的殺菌機(jī)制；采用Linear、Weibull和Log-Logistic 3種數(shù)學(xué)模型分析不同電壓下輝光放電等離子體殺菌動力學(xué)特性，旨在篩選最適合描述低溫等離子體殺菌過程的動力學(xué)模型，為低溫等離子體殺菌技術(shù)的發(fā)展提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Fusarium solani菌株由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供（從當(dāng)歸中分離）。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）、孟加拉紅瓊脂（rose bengal agar，RBA），青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；無水硫酸鈉，分析純，上海中泰化學(xué)試劑有限公司；甲基紫，分析純，上海中泰化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

接觸輝光放電等離子體發(fā)生器（自制，圖1）；LDZX-50KBS型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；HPX-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；DH1722A-6型直流穩(wěn)壓穩(wěn)流電源，北京大華無線電儀器廠；CX221 FS1C型生物顯微鏡，奧林巴斯（廣州）工業(yè)有限公司；JSM-6360LV掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社；PHS-3C酸度計(jì)，上海平軒科學(xué)儀器有限公司；TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

圖1 試驗(yàn)裝置Fig.1 Experimental setup

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 CGDP的產(chǎn)生及·OH、H2O2、NO3-濃度和pH值的測定 如圖1所示，CGDP發(fā)生及反應(yīng)系統(tǒng)由反應(yīng)器和高壓直流電源兩部分組成。反應(yīng)器中的陽極為直徑0.5 mm的鉑電極，陰極為直徑1 cm的碳棒電極。反應(yīng)器外設(shè)循環(huán)水浴控制溫度。調(diào)節(jié)電壓至鉑電極發(fā)生穩(wěn)定輝光放電而使水分子活化并產(chǎn)生等離子體。為防止樣品中其他因素的干擾，本試驗(yàn)采用無菌水代替樣品，以檢測CGDP處理過程中活性粒子濃度的變化。540 V電壓下，取一定體積的無菌水，其他條件相同，進(jìn)行放電處理，每隔5 min取樣，共30 min，平行3次。溶液中NO3-濃度采用二磺酸酚分光光度法進(jìn)行測定［16］；·OH的測定參考杜明遠(yuǎn)等［17］的方法，以甲基紫為捕獲劑；H2O2測定使用南京建成過氧化氫（H2O2）試劑盒。

1.3.2 菌株活化和孢子懸浮液的制備 取培養(yǎng)7 d的Fusarium solani一皿，加入10 mL無菌水（含有0.01 mL吐溫80），使用無菌三角涂布器刮下菌落，四層無菌紗布過濾，所得溶液即為孢子懸浮液。吸取1 μL孢子懸浮液至血球計(jì)數(shù)板，置于顯微鏡下計(jì)數(shù)，無菌水稀釋調(diào)節(jié)孢子濃度至2 × 106CFU·mL-1。

1.3.3 CGDP對殺菌效果的影響 為了研究電壓、處理時間、孢子初始濃度和抗壞血酸濃度對等離子體殺菌效果的影響。取50 mL無菌水，通過調(diào)節(jié)電源電壓從0 V增加到650 V，測定電流隨電壓的變化曲線，確定CGDP產(chǎn)生的電壓范圍；取50 mL濃度為2×106CFU·mL-1的孢子懸浮液在不同電壓（500、520、540、560、580 V）下用CGDP處理；取50 mL不同初始濃度（4×105、2×106、3×106、4×106CFU·mL-1）和含有不同濃度抗壞血酸（5、10、20 mmol·L-1）的孢子懸浮液，分別在540 V下用CGDP處理。所有樣品每隔5 min取樣，共30 min，平行3次，將取好的樣品于25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)。等離子體對Fusarium solani的殺菌效果用孢子減少量表示。孢子減少量為處理樣品和未處理樣品菌落計(jì)數(shù)的對數(shù)之差，見公式（1）。

式中，N：處理后樣品的菌落數(shù)，CFU·mL-1；N0：處理前樣品的菌落數(shù)，CFU·mL-1；lgS：殺菌處理前后菌落總數(shù)降低的對數(shù)。

1.3.4 CGDP處理對Fusarium solani生長、細(xì)胞膜完整性及孢子形態(tài)的影響 取50 mL濃度為2×106CFU·mL-1的孢子懸浮液，540 V條件下，CGDP處理0（CK）、5、10、15、20、25和30 min后分別測定其各種生理指標(biāo)。孢子萌發(fā)率參考杜明遠(yuǎn)等［17］的方法，通過生物顯微鏡觀察統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)數(shù)；通過十字交叉法測定菌落直徑和菌絲生物量；核酸泄漏量和蛋白質(zhì)泄漏量通過紫外吸收法測定，核酸泄漏量和蛋白質(zhì)泄漏量分別用OD260和OD280表示；孢子碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色參考王志芳等［18］的方法，并通過熒光顯微鏡觀察結(jié)果；掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）前處理參考潘春青［19］的方法，在5 000倍掃描電鏡視野下觀察、拍照。

1.3.5 殺菌動力學(xué)模型及評價 常見的動力學(xué)模型有三類，分別是Linear模型、Weibull模型和Log-Logistic模型。運(yùn)用MatLab1.0.01軟件分別對所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合，得到不同電壓下CGDP處理過程中，F(xiàn)usarium solani菌落數(shù)下降值隨處理時間變化的動力學(xué)方程。并且引入相關(guān)系數(shù)（R2）、精確因子（Af）、偏差因 子（Bf）和 均方 根方 差（root mean square error，RMSE）四個參數(shù)評價擬合效果。其中R2是評價模型擬合優(yōu)度的度量值，值越接近1代表模型擬合程度越佳；Af和Bf為預(yù)測值與實(shí)測值的偏離程度，Af與Bf值越接近1，代表預(yù)測值與實(shí)測值偏離程度越低；RMSE表示模型擬合的精確性，值越小代表模型擬合精確度越高。其表達(dá)式如表1所示。

表1 3種動力學(xué)模型數(shù)學(xué)表達(dá)式及模型參數(shù)Table 1 Mathematical expressions and model parameters for three kinetic models

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Excel 2016和SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析（analysis of variance，ANOVA），結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（P<0.05），并用Origin 2018和MatLab1.0.01軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CGDP對·OH、H2O2、NO3-濃度及pH值的影響

等離子體殺菌過程中，由于受等離子體自身粒子不穩(wěn)定性以及細(xì)胞多樣性影響，其殺菌機(jī)理目前仍處于探索階段，其中公認(rèn)最多的是等離子體氧化殺菌。CGDP處理時，當(dāng)施加于針狀電極的電壓達(dá)到某一擊穿電壓時，電極附近的水分子會被活化成H2O+，并通過電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生·OH和·H，進(jìn)而生成H2和O2，這一區(qū)域又被稱為等離子體區(qū)。在等離子體區(qū)附近的液相區(qū)，液體中的水分子又與來自電極附近的H2O+gas相互撞擊分解成H和O，進(jìn)一步生成H2O2；同時水分子還與H2O+發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移生成·OH，這些物質(zhì)從等離子體層遷移，進(jìn)而充滿整個溶液。它們不但可以相互作用，還可以與底物發(fā)生反應(yīng)［13］。

另外，在放電過程中還會形成活性氮粒子，這些粒子在水中形成亞硝酸和硝酸等酸性物質(zhì)，使樣品酸化，從而抑制菌體生長。

表2為540 V電壓下CGDP處理后測量得到的·OH、H2O2、NO3-濃 度 和pH值。與0 min相比，CGDP處理30 min，·OH和H2O2濃度分別增加到1.57 mg·L-1和73.89 mmol·L-1，且表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05）；NO3-濃度在30 min內(nèi)隨著處理時間的延長而線性增加，最高達(dá)到12.72 mg·L-1；pH值經(jīng)CGDP處理后從7.07降低到4.66（30 min）。Annachiara等［20］在分析氣體等離子體對水溶液中化學(xué)物質(zhì)的影響時也得到了類似的結(jié)果，并推測活性粒子濃度的增加可能是微生物失活的主要原因。

表2 540 V條件下CGDP過程中·OH、H2O2、NO3-濃度及pH值Table 2 ·OH， H2O2 and NO3- concentrations and pH in the CGDP process at 540 V

2.2 CGDP伏安特性

CGDP處理過程中電流-電壓關(guān)系如圖2所示。結(jié)果表明，電流隨電壓的變化主要分為3個階段：AB段為普通的電解過程，在此范圍內(nèi)電流與電壓呈線性正相關(guān)關(guān)系，并符合法拉第定律；BC段為不穩(wěn)定區(qū)，前期電流隨電壓的增大而急劇下降，并伴隨著氣泡的產(chǎn)生，之后隨著電壓的增大出現(xiàn)劇烈波動；CD段為輝光放電區(qū)，當(dāng)電壓調(diào)節(jié)到C點(diǎn)（500 V）時，電極尖端開始出現(xiàn)紫色的輝光，且隨著電壓的增大輝光放電逐漸穩(wěn)定，水分子被活化并產(chǎn)生等離子體，此段也稱為等離子體區(qū)。本試驗(yàn)選擇輝光放電穩(wěn)定的最低電壓為540 V。

圖2 CGDP處理過程中電流-電壓特征曲線Fig.2 Current-voltage characteristic curve during CGDP processing

2.3 電壓及處理時間對CGDP殺菌效果的影響

在能夠穩(wěn)定產(chǎn)生CGDP的電壓范圍內(nèi)，本試驗(yàn)研究了電壓在500～580 V之間CGDP處理對Fusarium solani殺菌效果的影響。結(jié)果表明（表3），在相同的處理時間下，隨著電源電壓的升高，F(xiàn)usarium solani孢子的存活數(shù)逐漸降低；在相同的電壓下，隨著處理時間的延長，樣品中孢子存活數(shù)逐漸減少。當(dāng)電壓為500 V時，與對照相比，CGDP處理20 min時，孢子對數(shù)值下降了0.19 lg（CFU·mL-1），繼續(xù)升高電壓為560 V時，樣品中孢子對數(shù)值下降了2.5 lg（CFU·mL-1），大多數(shù)孢子被殺死，當(dāng)電壓升高到580 V時，可殺死全部孢子。此外，當(dāng)電壓為540 V時，CGDP處理20 min使孢子對數(shù)值下降了2.66 lg（CFU·mL-1），繼續(xù)延長處理時間至25 min時，樣品中沒有活孢子檢出。殺菌效果是處理時間及電壓強(qiáng)度共同作用的結(jié)果，因此，后續(xù)研究采用電壓強(qiáng)度作為動力學(xué)研究的變量。

表3 電壓及處理時間對Fusarium solani孢子殺菌效果的影響Table 3 Effect of voltage and time on the fungicidal effect of Fusarium solani spores /lg（CFU·mL-1）

2.4 抗壞血酸對CGDP殺菌效果的影響

由圖3可知，540 V電壓下，CGDP處理后，隨著處理時間的延長，對照組菌落存活數(shù)逐漸減少，殺菌效果增強(qiáng)。當(dāng)加入一定濃度的抗壞血酸后，菌落存活數(shù)增加，殺菌效果減弱。加入5 mmol·L-1的抗壞血酸，CGDP處理30 min時，與對照相比，菌落存活數(shù)下降了3.6 lg（CFU·mL-1）。繼續(xù)提高抗壞血酸濃度到10 mmol·L-1和20 mmol·L-1，菌落存活數(shù)下降速率降低，CGDP處理20 min時，菌落存活數(shù)僅為對照組的46.4%和56.9%，基本保持不變。這可能是抗壞血酸的濃度過高所導(dǎo)致，此時抗壞血酸對活性氧的抑制即將達(dá)到飽和狀態(tài)。

圖3 抗壞血酸對Fusarium solani孢子殺菌效果的影響Fig.3 Effect of ascorbic acid on the fungicidal effect of Fusarium solani spores

2.5 Fusarium solani孢子初始濃度對CGDP殺菌效果的影響

電源電壓540 V下，考察Fusarium solani不同孢子濃度對CGDP殺菌效果的影響，結(jié)果如圖4所示。在不同的初始濃度條件下，CGDP對Fusarium solani孢子都有著明顯的殺菌效果。當(dāng)初始濃度為4×105CFU·mL-1時，CGDP處理20 min，可全部殺死樣品中孢子，當(dāng)初始濃度為2×106、3×106CFU·mL-1時，殺死全部孢子所需時間分別為25和30 min。繼續(xù)提高孢子初始濃度至4×106CFU·mL-1時，CGDP處理30 min未能殺死全部孢子。由此可知，提高孢子濃度會降低殺菌效率。

圖4 Fusarium solani孢子初始濃度對CGDP殺菌效果的影響Fig.4 Effect of initial concentration of Spores of Fusarium solani on bactericidal effect of CGDP

2.6 CGDP處理對Fusarium solani生長、細(xì)胞膜完整性及孢子形態(tài)的影響

微生物結(jié)構(gòu)的完整性是保證其生長及各種代謝活動的基礎(chǔ)。表4反映了CGDP處理對Fusarium solani孢子生長抑制以及細(xì)胞膜破壞作用。結(jié)果表明，隨著CGDP處理時間的延長，菌落直徑整體顯著減?。≒<0.05）。處理時間為0 min時，對照組菌落直徑為5.53 cm，而處理時間為20 min時，菌落直徑減小至3.23 cm，僅為對照組的58.4%；繼續(xù)延長處理時間至25 min，未發(fā)現(xiàn)菌絲生長。另外，菌絲生物量和孢子萌發(fā)率也隨著CGDP處理時間的延長而顯著降低（P<0.05）。處理時間為20 min時，菌絲生物量為對照組的4.45%，孢子萌發(fā)率較比照組下降98.47個百分點(diǎn)；繼續(xù)延長處理時間，F(xiàn)usarium solani無孢子萌發(fā)，菌絲生物量也無積累，此結(jié)果與菌落直徑對應(yīng)，同時也證明CGDP處理25 min可對Fusarium solani孢子達(dá)到完全滅活。

表4 CGDP處理對Fusarium solani孢子生長及細(xì)胞膜完整性的影響Table 4 Effect of CGDP treatment on the growth and cell membrane integrity of Fusarium solani spores

碘化丙啶（PI）不能透過完整的細(xì)胞膜，但能染紅細(xì)胞膜有破損的細(xì)胞。由表4可知，F(xiàn)usarium solani胞內(nèi)核酸泄漏量隨著CGDP處理時間的延長而顯著增大（P<0.05）；蛋白質(zhì)泄漏量在CGDP處理前10 min幾乎無變化，繼續(xù)延長處理時間，蛋白質(zhì)泄漏量增加，但差異不顯著。處理時間為20 min時，核酸泄漏量和蛋白質(zhì)泄漏量的增加量分別為對照組的40%和9%，表明Fusarium solani細(xì)胞膜出現(xiàn)了損傷或破碎。圖5也證明了這一結(jié)果，即未處理的Fusarium solani孢子活性較高，均未被PI染色劑染色，而處理后的Fusarium solani孢子均出現(xiàn)可見熒光，且隨著CGDP處理時間的延長，熒光強(qiáng)度愈加明顯。

SEM圖顯示了CGDP處理對Fusarium solani孢子形態(tài)的影響，圖5-G為未經(jīng)CGDP處理的孢子形態(tài)，圖5-H和I分別為經(jīng)CGDP處理15和30 min的孢子形態(tài)圖。由圖5-G可以看出，未經(jīng)CGDP處理的Fusarium solani孢子呈規(guī)則的鐮刀狀，且表面光滑、內(nèi)部飽滿、有3條不明顯的棱膜；CGDP處理15 min后，F(xiàn)usarium solani孢子形態(tài)發(fā)生明顯變化，孢子表面變得粗糙，且內(nèi)部發(fā)生皺縮，3條棱膜開始變得明顯。當(dāng)CGDP處理時間延長至30 min時，孢子表面愈發(fā)粗糙，且出現(xiàn)明顯的破損，胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生泄漏，3條棱膜也可明顯地觀察到。此外，對比圖5-G、H、I可明顯觀察到，隨著處理時間的延長，等離子體對Fusarium solani孢子形態(tài)的破壞加重。

圖5 CGDP處理Fusarium solani孢子PI染色圖和SEM圖Fig.5 PI staining and SEM images of CGDP-treated Fusarium solani spores

2.7 模型擬合分析

采用3種常見的微生物致死模型Linear模型、Weibull模型和Log-Logistic模型，分別對不同電壓下，CGDP處理過程中，F(xiàn)usarium solani孢子隨處理時間變化的失活曲線進(jìn)行擬合，擬合參數(shù)如表5所示。Linear模型經(jīng)常被用來反映殺菌過程中，微生物存活數(shù)隨處理時間變化的關(guān)系。500～580 V不同電壓下，CGDP處理Fusarium solani失活曲線決定系數(shù)（R2）分別為0.722 3、0.464 0、0.754 1、0.736 0和0.775 5，決定系數(shù)較低，表明CGDP處理對Fusarium solani的失活過程不符合Linear模型。同時，CGDP處理過程中產(chǎn)生的活性粒子對Fusarium solani孢子致死效應(yīng)存在差異，導(dǎo)致在整個過程中致死效率不相同。因此，Linear模型不適用于描述CGDP處理?xiàng)l件下微生物的致死規(guī)律。

運(yùn)用另外2種常見的微生物致死模型（Weibull、Log-Logistic模型），進(jìn)行CGDP處理過程中失活曲線的擬合。不同電壓下，2種擬合方程決定系數(shù)均高于0.823 7（表5），表明這2種模型可較好地?cái)M合CGDP對Fusarium solani孢子失活曲線。

表5 3種模型擬合CGDP殺滅Fusarium solani 孢子動力學(xué)曲線參數(shù)Table 5 Parameters of the kinetic curves for CGDP killing of Fusarium solani spores fitted by the three models

為了衡量實(shí)測值與預(yù)測值之間的差異，以同一模型中實(shí)測值為橫坐標(biāo)，預(yù)測值為縱坐標(biāo)作圖，并進(jìn)行線性擬合得到?jīng)Q定系數(shù)（R2）。實(shí)測值與預(yù)測值越接近，擬合曲線斜率越接近1。由圖6可知，CGDP處理Fusarium solani實(shí)測值與3種模型預(yù)測值的關(guān)系曲線斜率存在一定差異。其中Linear、Log-Logistic模型關(guān)系曲線斜率相對較低，且截距較大，Weibull關(guān)系曲線斜率為0.893 1，較接近1。由表6可知，相比于其他兩種 模 型，Weibull模 型 的Af、Bf和R2更 接 近1，并 且RMSE較小，表明該模型可靠性高于其他模型。因此，在3個模型的整體比較中，Weibull模型能更好地?cái)M合CGDP處理過程中Fusarium solani的殺滅動力學(xué)曲線。

圖6 CGDP處理對Fusarium solani殺菌效果實(shí)測值與預(yù)測值相關(guān)性圖Fig.6 Correlation between measured and predicted values of the fungicidal effect of CGDP treatment on Fusarium solani

表6 3種模型評價參數(shù)的比較Table 6 Comparison of the evaluation parameters of the three models

3 討論

3.1 CGDP對Fusarium solani殺菌效果的影響及影響因素

在等離子體中，一般認(rèn)為高能電子、帶電粒子、紫外線、氧自由基等物質(zhì)與微生物的滅活有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著CGDP電壓的增加，殺菌效果逐漸提高。同時，CGDP處理過程中的活性粒子（·OH、H2O2和NO3-）濃度隨處理時間的延長而逐漸增大。這與Liu等［21］在研究接觸輝光放電產(chǎn)生的光發(fā)射特性和自由基時發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象相似，即當(dāng)施加電壓超過450 V時，自由基的強(qiáng)度隨外加電壓的增加而增加。其原因是當(dāng)施加電壓較低時，電子能量不足以活化更多水分子，使陽極尖端產(chǎn)生持續(xù)的活化粒子。本試驗(yàn)還表明，使用自由基清除劑抗壞血酸后，殺菌效果明顯降低。黃明明［22］研究等離子體對添加抗壞血酸沙門氏菌的殺菌效果時發(fā)現(xiàn)，隨著抗壞血酸的添加，沙門氏菌對等離子體的抗性增強(qiáng)。因此，推測CGDP過程中產(chǎn)生的活性粒子是殺菌的主要因素之一。對于高濃度的孢子，CGDP殺滅低濃度孢子的效率較大（圖4），在滑弧放電等離子體對大腸桿菌的滅菌效果研究中發(fā)現(xiàn)，穿透效應(yīng)是細(xì)菌失活的主要因素之一［23］。這可能是因?yàn)殒咦訚舛容^高時，CGDP處理過程中產(chǎn)生的高能離子不足以持續(xù)穿過細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，破壞胞內(nèi)電解質(zhì)，促使細(xì)胞死亡。此時殺菌作用可能主要來自活性氧（ reactive oxygen species，ROS）的氧化作用，而高速粒子的穿透效應(yīng)可以忽略不計(jì)。

3.2 CGDP對Fusarium solani生理指標(biāo)及細(xì)胞膜的影響

CGDP處理對Fusarium solani孢子生長及細(xì)胞膜完整性測定結(jié)果表明，隨著處理時間的延長，孢子的生長受到明顯的抑制。SEM和PI染色結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，經(jīng)CGDP處理后的孢子形態(tài)發(fā)生明顯變化，表面粗糙，可以觀察到嚴(yán)重破損現(xiàn)象，PI染色熒光強(qiáng)度也大幅度提高，這與李兆杰等［24］的研究一致。這可能是由等離子體中正負(fù)離子在微生物表面產(chǎn)生的剪切力大于其細(xì)胞膜表面張力，激活細(xì)胞表面刻蝕效應(yīng)所致［25］。通常，消毒產(chǎn)品中，乳酸分子的電離可以使細(xì)胞膜滲透性改變從而破壞底物。CGDP過程中觀察到溶液pH值由7.07降至4.66的酸化，可能導(dǎo)致類似的失活模式。然而等離子體引起的酸度增加并未被確定是造成細(xì)胞死亡的真正原因，Korachi等［26］通過觀察CGDP處理后的胞內(nèi)物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)活性粒子是造成DNA裂解導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的真正原因。Kim等［27］研究大氣壓等離子體射流（atmospheric pressure plasma jet，APPJ）對孢子的滅活機(jī)制時也表明，ROS等活性物質(zhì)是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的主要因素。

3.3 CGDP殺菌動力學(xué)模型

通過對殺菌效果和電壓強(qiáng)度關(guān)系的分析，得到CGDP處理Fusarium solani的動力學(xué)特征與Weibull模型擬合程度最高（R2=0.924 2），更符合CGDP殺菌過程中微生物致死規(guī)律。這與王英［28］關(guān)于低溫等離子體殺滅蘋果汁中耐高滲酵母的結(jié)果一致。但該模型是否適用于等離子體殺滅其他微生物動力學(xué)有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，CGDP能夠有效殺滅Fusarium solani孢子。升高電壓、延長處理時間和降低孢子初始濃度均能夠提高殺菌效果；當(dāng)CGDP處理20 min時，電壓從500 V升高到580 V，F(xiàn)usarium solani（2×106CFU·mL-1）菌落存活數(shù)減少6.05 lg（CFU·mL-1）；在540 V時，CGDP對孢子萌發(fā)率、菌絲生長量及菌落直徑的抑制作用均隨處理時間的延長而增大，處理時間為25 min時，抑制率達(dá)到100%；孢內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的滲漏量也隨處理時間的延長而增大，與0 min相比，處理時間為25 min時，分別增加了48%和13.6%；模型擬合結(jié)果表明，Weibull模型符合CGDP處理對Fusarium solani的殺菌動力學(xué)曲線。