任開明 楊文俊 王 犇 樊永惠 張文靜 馬尚宇 黃正來

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部黃淮南部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，安徽 合肥 230036）

氮素是小麥生長發(fā)育必需的大量元素之一，也是構(gòu)成小麥葉綠素、蛋白質(zhì)和核酸等結(jié)構(gòu)的重要元素［1］。氮代謝是小麥植株的基礎(chǔ)代謝過程，也是小麥生長發(fā)育過程中源庫關(guān)系形成的基礎(chǔ)，同時氮代謝對小麥產(chǎn)量品質(zhì)形成有重要影響［2］。合理施氮能夠改善小麥氮代謝，調(diào)節(jié)小麥植株碳氮代謝平衡，提升小麥產(chǎn)量品質(zhì)［3］。但近年來我國平均氮肥施用量相比發(fā)達(dá)國家仍然較高，很多農(nóng)戶為了追求產(chǎn)量盲目增加氮肥施用量，過量施用氮肥不僅造成環(huán)境污染，也會降低小麥氮素利用效率，同時產(chǎn)生小麥貪青晚熟、群體郁閉和碳氮代謝失衡等問題［4］。因此，探究合理氮肥施用量對降低過量施氮對環(huán)境的不利影響、提高小麥產(chǎn)量品質(zhì)和氮素利用率具有重要意義。

適量施用氮肥能夠提升灌漿期小麥籽粒蛋白含量和氮代謝相關(guān)酶活性，從而提高小麥灌漿期灌漿強度和小麥千粒重［5］。硝酸還原酶（nitrate reductase， NR）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase， GS）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminas， GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase， GOT）等是小麥氮代謝過程中的關(guān)鍵酶，上述氮素代謝關(guān)鍵酶活性會影響小麥對氮素的吸收利用和籽粒游離氨基酸含量［6-7］。在一定范圍內(nèi)增施氮肥能提高小麥氮素利用效率、籽粒NR、GS活性和籽粒蛋白質(zhì)含量［8］。同時，增施氮肥還能夠提高小麥的灌漿速率，延長小麥灌漿活躍期，增加小麥的粒重［9］。前人研究主要集中在施氮對小麥生長特性、產(chǎn)量品質(zhì)和干物質(zhì)積累轉(zhuǎn)運的影響方面，而關(guān)于氮肥運籌對灌漿期小麥籽粒氮代謝過程主要酶活性和籽粒蛋白質(zhì)組分變化影響的研究報道較少?；诖?，本試驗采用大田試驗研究氮肥運籌對灌漿期小麥氮代謝及蛋白質(zhì)合成的影響，旨在明確安徽省沿淮麥區(qū)稻茬小麥的合理施氮量，為小麥高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與試驗材料

試驗于2020年10月—2021年6月在兩個試驗地點進(jìn)行。試驗點一位于安徽省合肥市廬江縣安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)皖中綜合試驗站（31°48′N，117°23′E），試驗點二位于安徽省淮南市鳳臺縣農(nóng)技推廣中心（32°77′N，116°61′E）。兩個試驗地點播前土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分情況見表1。供試品種為弱筋小麥皖西麥0638，由六安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育。

表1 播前土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分Table 1 Soil basic nutrients before sowing

1.2 試驗設(shè)計

兩個試驗點分別設(shè)置0（N0）、75（N1）、150（N2）、225（N3）和300 kg·hm-2（N4）5個施氮處理，每處理3個重復(fù)，共15個小區(qū)，其中試驗點一小區(qū)面積為52 m2（26 m×2 m），試驗點二小區(qū)面積為36 m2（12 m×3 m）。氮肥（普通尿素，含N 46%）的基追比為7∶3，肥料以人工撒施方式施入，基本苗數(shù)為3.75×106株·hm-2。采用當(dāng)?shù)卮筇锲毡榱租浄适┯昧?，磷鉀肥在耕前全部基施，其中過磷酸鈣（含P2O512%）用量為75 kg·hm-2，氯化鉀（含K2O 60%）的用量為150 kg·hm-2。病蟲害防治及其他田間管理措施均與一般高產(chǎn)田塊一致。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 取樣方法 于開花期挑選長勢均勻且同時開花小麥掛牌標(biāo)記，花后7 d開始取樣，每隔7 d取掛牌小麥穗部（取樣時間均為無雨天氣上午9—11點），經(jīng)液氮冷凍，在-80 ℃下保存。樣品籽粒在冷凍條件下剝出并研磨，用離心機（美國Thermo Fisher公司）在低溫下離心，提取離心后的粗酶液用于氮素代謝相關(guān)酶測定。

1.3.2 氮代謝關(guān)鍵酶活性測定 硝酸還原酶（NR）活性參考王學(xué)奎［10］的方法進(jìn)行測定；谷氨酰胺合成酶（GS）活性參考董召娣等［11］的方法進(jìn)行測定；谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性參考吳良?xì)g等［12］的方法進(jìn)行測定。

1.3.3 游離氨基酸含量測定 采用茚三酮法［13］對小麥籽粒游離氨基酸含量進(jìn)行測定。

1.3.4 可溶性蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法［10］對小麥籽?？扇苄缘鞍缀窟M(jìn)行測定。

1.3.5 蛋白質(zhì)組分含量測定 將小麥灌漿期籽粒殺青、烘干后粉碎，參考趙乃新等［14］的方法測定小麥籽粒球蛋白、清蛋白、醇溶蛋白和麥谷蛋白含量。

1.3.6 籽粒灌漿動態(tài)測定 用Richards方程對小麥灌漿過程進(jìn)行擬合［15］，以千粒重W為因變量，開花后天數(shù)t為自變量，對冬小麥籽粒灌漿過程進(jìn)行擬合，并計算相應(yīng)的灌漿特征參數(shù)，分析籽粒灌漿特性，計算出理論最高千粒重（maximum 1 000 grain weight， W）、最大灌漿速率（maximum grouting rate， Vmax）、達(dá)最大灌漿速 率 時 間（time to reach the maximum grouting rate， Tmax）、平均灌漿速率（average grouting rate， Vave）、灌漿有效天數(shù)（effective days of grouting， T）以及漸增期、快增期、緩增期灌漿持續(xù)時間T1、T2、T3，漸增期、快增期、緩增期階段灌漿速率V1、V2、V3，漸增期、快增期、緩增期階段籽粒積累量W1、W2、W3。

1.3.7 土壤理化性質(zhì)測定 采用五點取樣法采集土壤樣品，取土壤表層0～20 cm土壤并混勻，在室內(nèi)自然風(fēng)干后過18目篩去除雜質(zhì)，篩后土壤送至安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院測定土壤pH值、有機質(zhì)、速效鉀和速效磷含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用WPS 2020進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作，采用SPSS 26軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用鄧肯法（Duncan）進(jìn)行差異顯著性檢驗（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮肥運籌對灌漿期小麥籽粒氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.1.1 硝酸還原酶（NR） 由圖1可知，試驗點一和試驗點二灌漿期小麥籽粒NR活性變化趨勢相同，隨著花后時間的延長，籽粒NR活性呈逐漸下降趨勢。相同時期和氮肥處理下NR活性總體表現(xiàn)為試驗點二高于試驗點一。隨著施氮量的增加，小麥籽粒NR活性呈上升趨勢。在花后14 d，與不施氮處理相比，施氮處理下試驗點一和試驗點二小麥籽粒NR活性分別提高了0.48%～28.26%和9.49%～23.02%。

圖1 不同施氮量處理下小麥籽粒NR活性Fig.1 NR activity of wheat grain under different nitrogen application rates

2.1.2 谷氨酰胺合成酶（GS） 由圖2可知，試驗點一和試驗點二灌漿期小麥籽粒GS活性表現(xiàn)出相同的變化趨勢，隨著花后時間的延長，籽粒GS活性呈逐漸下降趨勢，下降速率呈先慢后快再慢的趨勢，在花后7～14 d和21～28 d下降平緩，14～21 d快速下降。相同時期和氮肥處理下GS活性總體表現(xiàn)為試驗點二高于試驗點一。隨著施氮量的增加，小麥籽粒GS活性呈上升趨勢。在花后14 d，與不施氮處理相比，施氮處理下試驗點一和試驗點二小麥籽粒GS活性分別提高了7.65%～46.46%和15.97%～57.32%。

圖2 不同施氮處理下小麥籽粒GS活性Fig.2 GS activity of wheat under different nitrogen application treatments

2.1.3 谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT） 由圖3可知，兩試驗點籽粒GOT活性隨花后時間的延長呈逐漸下降趨勢，試驗點二小麥籽粒GOT活性在花后7～14 d下降較快。與不施氮處理相比，施氮增加了試驗點二小麥籽粒的GOT活性。隨著施氮量的增加，小麥籽粒GOT活性呈上升趨勢。在花后14 d，與不施氮處理相比，施氮處理下試驗點一和試驗點二小麥籽粒GOT活性分別提高了-5.58%～55.23%和29.76%～66.59%。

圖3 不同施氮處理下小麥GOT活性Fig.3 GOT activity of wheat under different nitrogen application treatments

2.1.4 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT） 由圖4可知，兩試驗點各施氮處理小麥GPT活性在花后7 d最高，在花后7～14 d快速下降。試驗點一和試驗點二灌漿期小麥籽粒GPT活性變化趨勢相同，隨著花后時間的延長，籽粒GPT活性呈逐漸下降趨勢。隨著施氮量的增加，小麥籽粒GPT活性呈上升趨勢。在花后14 d，與不施氮處理相比，施氮處理下試驗點一和試驗點二小麥籽粒GPT活性分別提高了18.79%～74.2%和10.31%～65.13%。

圖4 不同施氮處理下小麥GPT活性Fig.4 GPT activity of wheat under different nitrogen application treatments

2.2 氮肥運籌對灌漿期小麥籽粒蛋白質(zhì)合成的影響

2.2.1 游離氨基酸 由圖5可知，隨著花后時間的延長，兩試驗點籽粒游離氨基酸含量呈先上升后下降趨勢，在花后7～14 d總體上呈上升趨勢，并在花后14 d達(dá)到峰值，然后逐漸下降。隨著施氮量的增加，小麥籽粒游離氨基酸含量呈上升趨勢。在花后14 d，與不施氮處理相比，施氮處理下試驗點一和試驗點二小麥籽粒游離氨基酸含量分別提高了8.54%～29.91%和21.57%～45.63%。

圖5 不同施氮處理下小麥籽粒游離氨基酸含量Fig.5 Free amino acid content of wheat grain under different nitrogen application treatments

2.2.2 可溶性蛋白 由圖6可知，隨著花后時間的延長，兩試驗點小麥籽粒可溶性蛋白含量呈先上升后下降趨勢，在花后7～14 d快速上升，花后14～21 d快速下降。隨著施氮量的增加，小麥籽粒可溶性蛋白含量總體呈上升趨勢。在花后14 d，與不施氮處理相比，施氮處理下試驗點一和試驗點二小麥籽?？扇苄缘鞍缀糠謩e提高了1.47%～24.6%和-1.62%～26.36%。

圖6 不同施氮處理下小麥籽粒可溶性蛋白含量Fig.6 Soluble protein content of wheat grain under different nitrogen application treatments

2.2.3 蛋白質(zhì)組分 由圖7可知，隨著花后時間的延長，兩試驗點小麥籽粒麥谷蛋白含量呈逐漸上升趨勢。醇溶蛋白含量在花后7～14 d和21～35 d逐漸上升，14～21 d快速下降。在花后7～21 d，兩試驗點小麥籽粒清蛋白和球蛋白含量均隨花后時間的延長總體呈逐漸下降趨勢，在花后21～35 d，清蛋白含量持續(xù)下降，而球蛋白含量持續(xù)上升。隨著施氮量的增加，小麥籽粒各蛋白質(zhì)組分含量總體呈上升趨勢。由圖8可知，在N3處理下，試驗點一和試驗點二小麥花后35 d籽粒蛋白質(zhì)含量均能達(dá)到國家弱筋小麥蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)（12.5%），而N4處理下的小麥籽粒蛋白質(zhì)含量高于國家弱筋小麥蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)。隨著施氮量的增加，兩試驗點小麥籽粒蛋白質(zhì)含量逐漸增加，隨著花后時間的延長，小麥籽粒蛋白質(zhì)含量總體呈先升高、再降低，最后升高的變化趨勢。

圖7 不同施氮處理下小麥籽粒蛋白質(zhì)組分含量Fig.7 Protein component content of wheat grain under different nitrogen application treatments

圖8 不同施氮處理下小麥籽粒蛋白質(zhì)含量Fig.8 Grain protein content of wheat under different nitrogen application treatments

2.3 氮肥運籌對灌漿期小麥籽粒氮代謝關(guān)鍵酶活性與蛋白質(zhì)及其組分含量相關(guān)性的影響

由表2可知，灌漿期小麥籽粒氮代謝相關(guān)酶活性和蛋白質(zhì)及其組分含量均呈正相關(guān)。試驗點一和試驗點二小麥籽粒NR和GS活性與蛋白質(zhì)及其組分含量總體呈顯著或極顯著正相關(guān)。試驗點一GPT活性與籽粒蛋白質(zhì)各組分含量均無顯著相關(guān)性，GOT與醇溶蛋白呈正相關(guān)；試驗點二GPT活性與麥谷蛋白呈極顯著正相關(guān)，GOT活性與各蛋白質(zhì)組分含量均呈顯著或極顯著正相關(guān)，說明氮代謝相關(guān)酶活性的提高能促進(jìn)小麥籽粒蛋白質(zhì)的合成，增加游離氨基酸、籽粒蛋白質(zhì)及其組分含量和可溶性蛋白含量。

表2 不同施氮量下小麥籽粒氮代謝關(guān)鍵酶與蛋白質(zhì)組分及合成因素相關(guān)性Table 2 Correlation between key enzymes of wheat grain nitrogen metabolism and protein components and synthesis factors under different nitrogen application rates

2.4 氮肥運籌對灌漿期小麥籽粒灌漿和產(chǎn)量的影響

由圖9可知，隨著花后時間的延長，小麥籽粒灌漿速率呈先上升后下降趨勢，在花后14～21 d達(dá)到最大值，花后21 d之后快速下降。在花后14 d，與不施氮處理相比，施氮處理下試驗點一千粒重增加4.56%～12.28%，試驗點二N1和N2處理千粒重增加1.3%～9.35%，試驗點二N3和N4處理千粒重則減少0.52%～9.61%。由表3可知，增加施氮量總體上增加了試驗點一小麥的理論最高千粒重，提前了最大灌漿速率到達(dá)的時間，但降低了試驗點二最大灌漿速率和平均灌漿速率。同時，增加施氮量還降低了兩試驗點小麥階段籽粒積累量、試驗點一灌漿持續(xù)時間和試驗點二階段灌漿速率，但增加了試驗點一階段灌漿速率。由圖10可知，隨著施氮量的增加，試驗點一和試驗點二小麥籽粒產(chǎn)量呈先上升后下降趨勢，均在N3施氮量下達(dá)到最大值。

圖10 不同施氮處理下小麥籽粒產(chǎn)量Fig.10 Wheat grain yield under different nitrogen treatments

表3 不同施氮量下小麥灌漿參數(shù)Table 3 Grain filling parameters of wheat under different nitrogen application rates

圖9 不同施氮量下小麥籽粒灌漿速率Fig.9 Grain filling rate of wheat under different nitrogen application rates

3 討論

3.1 氮肥運籌對灌漿期小麥籽粒氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

NR、GS、GOT、GPT是小麥植株氮素代謝中的關(guān)鍵酶，其活性會影響小麥對氮素的利用和籽粒品質(zhì)［16］。李彥旬等［17］研究表明，灌漿期小麥籽粒NR、GS活性隨著花后天數(shù)的增加而降低，在一定范圍內(nèi)增加施氮量能提高小麥NR、GS活性。姜麗娜等［18］研究表明，小麥GPT活性在開花至花后一周無明顯變化，之后快速下降，在花后兩周后穩(wěn)定在一定范圍。前人研究表明，小麥植株內(nèi)NR、GS、GPT活性在花后7 d達(dá)到最大值，之后逐漸下降，不同施氮量處理下，氮代謝相關(guān)酶活性在240 kg·hm-2施氮量下達(dá)到最大值，且氮代謝相關(guān)酶活性與小麥籽粒蛋白質(zhì)含量、品質(zhì)呈顯著相關(guān)［19-20］。GOT和GPT是小麥蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，其活性隨花后天數(shù)增加呈逐漸下降趨勢［21-22］。本研究結(jié)果表明，灌漿期小麥氮代謝酶活性隨花后時間的延長呈下降趨勢，施氮能提高氮代謝相關(guān)酶活性，原因可能是增施氮肥增加了葉片相關(guān)抗氧化酶活性，從而延緩葉片衰老，使葉片內(nèi)氮代謝相關(guān)酶活性下降速度減慢。本研究關(guān)于小麥氮代謝酶活性隨施氮量的增加而持續(xù)增加的結(jié)果與前人有所不同［17］，可能是由于皖西麥0638為弱筋小麥，植株內(nèi)氮代謝酶對氮素響應(yīng)程度較低，在較高施氮量條件下仍能提升相關(guān)酶活性。

3.2 氮肥運籌對灌漿期小麥籽粒蛋白質(zhì)合成的影響

小麥植株內(nèi)的氮化物主要以氨基酸的形式存在和運輸，可溶性蛋白含量可以反映小麥氮代謝水平，影響小麥籽粒蛋白質(zhì)含量高低，在小麥同化物代謝中發(fā)揮重要作用［5］。董偉欣等［23］研究表明，小麥植株內(nèi)可溶性蛋白和可溶性糖含量隨施氮量的增加而增加，在花后7和21 d無明顯變化，在花后35 d迅速降低。李艷等［24］研究表明，隨著施氮量的增加，小麥植株內(nèi)游離氨基酸含量、花后氮同化量均逐漸上升。本研究結(jié)果表明，小麥植株內(nèi)可溶性蛋白和游離氨基酸含量隨花后時間的延長呈先上升后下降趨勢，與前人研究結(jié)論一致［25］。前人研究表明，增加施氮量可以增加穗數(shù)和穗粒數(shù)，但會降低平均灌漿速率和漸增區(qū)灌漿速率［26］；在一定施氮范圍內(nèi)，小麥籽粒各蛋白質(zhì)組分含量均隨施氮量的增加而增加［27-28］。本研究表明，在0～300 kg·hm-2施氮量范圍內(nèi)，增加施氮量能提高灌漿期小麥籽粒各蛋白質(zhì)組分含量和籽粒蛋白質(zhì)含量，可能是由于施氮增加了各蛋白質(zhì)組分合成的原料和相關(guān)合成酶活性，從而促進(jìn)籽粒蛋白質(zhì)含量的提高。小麥籽粒產(chǎn)量隨施氮量的增加呈先上升后下降趨勢，過高的施氮量可能會使小麥貪青晚熟，從而導(dǎo)致產(chǎn)量降低，籽粒產(chǎn)量在225 kg·hm-2施氮處理下達(dá)到最大值。前人研究表明，小麥植株內(nèi)GS和GPT活性與籽粒蛋白質(zhì)含量呈極顯著相關(guān)性［29-30］。本研究發(fā)現(xiàn)，灌漿期籽粒氮代謝相關(guān)酶活性總體與籽粒游離氨基酸、可溶性蛋白、麥谷蛋白和清蛋白含量呈顯著或極顯著正相關(guān)。由此可見，增加施氮量可提高小麥籽粒NR、GS、GOT、GPT活性，提高籽粒游離氨基酸、可溶性蛋白含量，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，增加施氮量能夠提升灌漿期小麥籽粒氮素代謝關(guān)鍵酶NR、GS、GOT、GPT活性，同時增加灌漿期小麥籽粒游離氨基酸、可溶性蛋白和籽粒蛋白質(zhì)組分含量，但當(dāng)施氮量大于225 kg·hm-2時，小麥籽粒蛋白質(zhì)含量會高于國家弱筋小麥籽粒蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)，且繼續(xù)增加施氮量會降低小麥籽粒產(chǎn)量。因此認(rèn)為，225 kg·hm-2施氮量是調(diào)控安徽省沿淮稻茬麥區(qū)小麥氮素營養(yǎng)、提升弱筋小麥品質(zhì)產(chǎn)量、降低過量施氮對環(huán)境影響的合理施氮量。