桂意云 李海碧， 韋金菊 周 會(huì) 祝 開 趙培方 劉昔輝， 區(qū)惠平，

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心∕廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所∕農(nóng)業(yè)農(nóng)村部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∕廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；2廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西 崇左 532400；3云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，云南 開遠(yuǎn) 661699）

穩(wěn)定性同位素13C脈沖標(biāo)記技術(shù)是研究植物光合作用及其光合碳在植物-土壤-大氣系統(tǒng)中周轉(zhuǎn)規(guī)律的科學(xué)高效方法之一［1-3］。借助穩(wěn)定性同位素13C脈沖標(biāo)記技術(shù)，可了解植物各生育時(shí)期光合碳的分配信息［4］，也可科學(xué)區(qū)分不同碳源，從而更好地揭示土壤有機(jī)碳及其組分的分解程度和周轉(zhuǎn)速率，以及示蹤碳的遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程［5-6］。目前，科研用13C標(biāo)記材料主要通過(guò)脈沖標(biāo)記獲取。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者標(biāo)記的材料主要涉及小麥［1-3］、水稻［7-8］、玉米［9-11］、大豆和濕地植物［12］等?；衾蚶虻龋?2］研究表明，每次標(biāo)記通入豐度99%、純度99.999%的13CO2氣體10 L 4 h，共標(biāo)記4次，所獲得的濕地植物根、莖和葉的Atom%13C是未標(biāo)記植物的1.03、1.78和0.91倍，大豆根、莖和葉的Atom%13C是未標(biāo)記的1.20、2.19和2.99倍，大豆標(biāo)記效果優(yōu)于濕地植物。由此可知，不同作物的標(biāo)記效果存在差異。

甘蔗（Saccharumspp.）是全球重要的能源作物和糖料作物。甘蔗光合CO2補(bǔ)償點(diǎn)低（1～10 mg·m-3），光合作用最適溫度高（30～45 ℃），CO2固定效率和同化率高，因此，甘蔗被認(rèn)為是碳中和背景下優(yōu)選的C4作物［13］。利用穩(wěn)定性同位素13C脈沖標(biāo)記技術(shù)研究甘蔗光合作用、光合碳去向以及碳周轉(zhuǎn)是當(dāng)前應(yīng)對(duì)全球氣候變化影響的研究熱點(diǎn)之一。然而，利用穩(wěn)定性同位素13C脈沖標(biāo)記技術(shù)探討甘蔗13C富集的研究較少，亟需開發(fā)一種簡(jiǎn)單易行、低量高效、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的標(biāo)記方法。因此，本研究以甘蔗品種桂糖58號(hào)為試驗(yàn)材料，探索苗期甘蔗13C脈沖標(biāo)記方法及標(biāo)記效率，同時(shí)分析脈沖標(biāo)記期間甘蔗營(yíng)養(yǎng)元素的變化，旨在為甘蔗同位素的高效標(biāo)記以及標(biāo)記期間甘蔗的養(yǎng)分管理提供參考依據(jù)，并為進(jìn)一步研究甘蔗秸稈碳在大氣-植物-土壤中的周轉(zhuǎn)提供科學(xué)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤采自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院院本部甘蔗試驗(yàn)地，采樣深度0～15 cm。土壤取回后自然風(fēng)干，去除植物殘?bào)w，粉碎、研磨過(guò)2 mm篩備用。土壤理化性質(zhì)為：pH（H2O，土∶水=1∶2.5）值6.18，有機(jī)質(zhì)含量17.1 g·kg-1，堿解氮含量48.3 mg·kg-1，速效磷含量0.3 mg·kg-1，速效鉀含量75.6 mg·kg-1。供試甘蔗品種為桂糖58號(hào)（GT58），由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所提供。

1.2 桶栽試驗(yàn)

試驗(yàn)在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所智能溫室大棚采用桶栽進(jìn)行。試驗(yàn)用桶直徑25 cm，高35 cm，每桶裝過(guò)2 mm篩的風(fēng)干土15 kg。每桶施用尿素30 g，鈣鎂磷肥37 g，硫酸鉀20 g。2020年3月18日進(jìn)行甘蔗催芽，3月25日選取長(zhǎng)勢(shì)一致的蔗苗移栽至試驗(yàn)桶內(nèi)，每桶4株，共種植42桶。

1.3 13C脈沖標(biāo)記試驗(yàn)

試驗(yàn)于2020年5月11日開始，設(shè)置0、0.32、0.64和1.28 g·m-3Na213CO34個(gè)用量水平，分別記為CK、T1、T2和T3。CK擺放在單獨(dú)的溫室大棚內(nèi)，避免污染。標(biāo)記在自制全密閉標(biāo)記室進(jìn)行。標(biāo)記室由聚乙烯膜和直徑20 mm的聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）塑管支架制成，其長(zhǎng)×寬×高分別為1.25 m×1 m×1.25 m。內(nèi)置1臺(tái)外控小風(fēng)扇、溫度計(jì)、2個(gè)裝13C豐度為99%的Na213CO3的燒杯（對(duì)角放），外置2個(gè)裝鹽酸的輸液瓶。標(biāo)記每隔7 d進(jìn)行1次，共標(biāo)記6次。標(biāo)記時(shí)間為10：00—16：00。標(biāo)記步驟如下：標(biāo)記前，將栽植甘蔗的試驗(yàn)桶放進(jìn)標(biāo)記室，每處理放置9桶；用透明膠帶粘貼密封出入口；開啟標(biāo)記室內(nèi)頂端中間的風(fēng)扇；5 min后，迅速通過(guò)外置輸液瓶向標(biāo)記室內(nèi)裝有Na213CO3的燒杯中一次性注入100 mL 2 mol·L-1的HCl（確保室內(nèi)的Na213CO3完全反應(yīng)，釋放13CO2）；標(biāo)記結(jié)束后，關(guān)閉風(fēng)扇，將甘蔗移出標(biāo)記室，放置于溫室大棚，常規(guī)管理。

1.4 樣品采集與制備

分別在第2、第4和第6次標(biāo)記結(jié)束后的第7天隨機(jī)選擇標(biāo)記和未標(biāo)記的甘蔗各3桶進(jìn)行破壞性采樣。從基部剪斷蔗葉（標(biāo)記時(shí)甘蔗處于苗期，以蔗葉為主），同時(shí)將全部土壤倒出平鋪于干凈的農(nóng)膜上，挑出根系，先用自來(lái)水沖洗根系上黏附的土壤，再用蒸餾水洗凈、瀝干后，將蔗葉與根系分別置于105 ℃烘箱中殺青15 min，65 ℃恒溫烘干至恒重，粉碎過(guò)100目篩待測(cè)。同時(shí)，在第6次標(biāo)記開始時(shí)（注酸后2 min）及結(jié)束后均用注射器采集標(biāo)記室內(nèi)的氣體用于CO2濃度和δ13C-CO2分析。

1.5 分析方法

蔗葉及根系的N含量采用凱氏定氮法測(cè)定，P含量采用鉬藍(lán)比色法測(cè)定，K含量采用火焰光度法測(cè)定［14］。蔗葉全碳含量以及δ13C值采用元素分析儀-同位素質(zhì)譜儀（德國(guó)Elementar公司）測(cè)定，CO2濃度和δ13C-CO2采用高精度碳同位素分析儀（美國(guó)Picarro公司）測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)處理[12, 15]

未標(biāo)記作物的自然豐度用δ13C值表示，其計(jì)算公式如下：

式中，RS為樣品的13C∕12C值；PDB為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，RPDB為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的13C∕12C值，為0.011 237 2。

標(biāo)記作物的同位素豐度用F（%）來(lái)表示，F(xiàn)（%）與δ13C（‰）的轉(zhuǎn)化公式如下：

蔗葉、根系固定的13C量計(jì)算公式如下：

式中，13C為蔗葉的13C量（mg）；C為蔗葉全C含量（g）；F為標(biāo)記組13C豐度；Fck為未標(biāo)記組13C豐度。蔗葉、根系標(biāo)記效率Em計(jì)算公式如下：

式中，Cat為添加到標(biāo)記室的13C總量，其中1 g純度為99%的Na2

13CO3中含13C量為0.12 g。采用Excel 2007和Origin 8.0軟件作圖，DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，最小顯著差異法（least significant difference， LSD）進(jìn)行多重比較。

“動(dòng)物行為的生理基礎(chǔ)”是蘇教版初中《生物學(xué)》教材八年級(jí)上冊(cè)第18章“動(dòng)物的行為”第2節(jié)內(nèi)容，包含“動(dòng)物行為的獲得途徑”和“動(dòng)物行為的生理基礎(chǔ)”兩部分。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)記室CO2和δ13C-CO2濃度變化

由表1可知，標(biāo)記開始時(shí)各處理的標(biāo)記室內(nèi)CO2濃度約為960.0 mg·m-3，各處理間差異不顯著；標(biāo)記6 h后，CO2濃度降至551.7～750.5 mg·m-3之間，各處理間差異顯著，同時(shí)該濃度較標(biāo)記開始時(shí)下降21.7%～42.3%，以T2處理降幅最大，高達(dá)42.3%，T3處理次之（40.1%），T1和CK處理較低，約為22%，與T2和T3差異顯著。

表1 標(biāo)記室內(nèi)CO2濃度變化Table 1 The change of CO2 concentration in close chamber

由表2和圖1可知，標(biāo)記開始時(shí)，每增加1個(gè)Na2

圖1 標(biāo)記開始時(shí)標(biāo)記室內(nèi)δ13C-CO2特征Fig.1 The dynamic change of δ13C-CO2

表2 標(biāo)記室內(nèi)δ13C-CO2變化Table 2 The change of δ13C-CO2 in close chamber

13CO3標(biāo)記濃度梯度，標(biāo)記室內(nèi)的δ13C-CO2以5 886.5‰的速率線性增加，標(biāo)記結(jié)束后，δ13C-CO2整體呈下降趨勢(shì)，降幅為2 108.2～7 550.9個(gè)千分點(diǎn)，并隨Na213CO3標(biāo)記濃度的增加而增加。

2.2 蔗葉和根系δ13C和F值動(dòng)態(tài)特征

由圖2可知，蔗葉中的δ13C值高于根系。未標(biāo)記的蔗葉和根系的δ13C值無(wú)明顯變化，分別為-0.80‰和-13.04‰。而標(biāo)記的蔗葉和根系δ13C值隨著標(biāo)記次數(shù)的增加而明顯富集，且蔗葉δ13C值增加速率隨著Na213CO3標(biāo)記濃度的增加而增加，以T3處理的增加速率最高，每標(biāo)記1次，蔗葉δ13C值增加85.841‰。根系δ13C值在T1處理下隨著標(biāo)記次數(shù)的增加呈線性增加，每標(biāo)記1次，根系δ13C值增加4.094‰。在T2和T3處理下，根系δ13C值與標(biāo)記次數(shù)呈一元二次關(guān)系。

圖2 不同處理下蔗葉與根系的δ13C動(dòng)態(tài)變化Fig.2 The dynamic change of δ13C in sugarcane leaves and roots among different treatments

由圖3可知，蔗葉和根系F值表現(xiàn)出與δ13C值同樣的變化趨勢(shì)。未標(biāo)記的甘蔗蔗葉和根系的F值隨著標(biāo)記次數(shù)的增加無(wú)明顯變化，其他Na213CO3標(biāo)記濃度的甘蔗蔗葉F值隨著標(biāo)記次數(shù)的增加呈線性增加，且蔗葉F值增加速率隨著Na213CO3標(biāo)記濃度的增加而成倍增加，以T3處理增加速率最高，每標(biāo)記1次，蔗葉F值平均約增加0.094%。根系F值在T1處理下隨著標(biāo)記次數(shù)的增加呈線性增加，每標(biāo)記1次，根系F值平均約增加0.004%。在T2和T3處理下，根系F值與標(biāo)記次數(shù)呈一元二次關(guān)系。標(biāo)記6次后，蔗葉F值較CK增加了0.08～0.40個(gè)百分點(diǎn)，根系F值較CK增加了0.03～0.29個(gè)百分點(diǎn)。

圖3 不同處理下蔗葉與根系的F值動(dòng)態(tài)變化Fig.3 The dynamic change of F in sugarcane leaves and roots among different treatments

2.3 不同13CO2濃度脈沖標(biāo)記次數(shù)下的標(biāo)記效率

表3 不同13CO2脈沖標(biāo)記次數(shù)下的標(biāo)記效率Table 3 Labeling efficiency at different 13CO2 pulse labeling numbers /%

2.4 不同13CO2脈沖標(biāo)記下蔗葉、根系中N、P、K含量變化

對(duì)蔗葉、根系中的N、P、K含量進(jìn)行分析，有助于提升對(duì)13CO2脈沖標(biāo)記下養(yǎng)分管理的認(rèn)識(shí)。圖4表明，13C標(biāo)記蔗葉的N含量整體顯著高于或相當(dāng)于未標(biāo)記蔗葉。P含量在標(biāo)記4次后表現(xiàn)為T1和T2處理顯著高于CK處理，而T3處理顯著低于CK處理。13C標(biāo)記蔗葉的K含量均顯著高于未標(biāo)記蔗葉，增幅為6.0%～31.8%。標(biāo)記6次后，T1和T2處理蔗葉N、P、K含量無(wú)顯著差異，但均顯著高于T3處理。

圖4還表明，標(biāo)記4次后，除了T1處理的根系P含量顯著高于CK處理外，標(biāo)記根系的N、P、K含量均整體顯著低于CK處理，其中N含量降幅為7.9%～32.9%，P含量降幅為0.9%～20.7%，K含量降幅為21.9%～47.9%。

圖4 不同處理下蔗葉與根系N、P、K含量變化Fig.4 The dynamic change of N， P and K in sugarcane leaves and roots among different treatments

將蔗葉N、P、K含量與根系N、P、K含量進(jìn)行線性擬合（表4），結(jié)果表明，除了第4次標(biāo)記的N含量外，蔗葉N、K含量與根系N、K含量均呈顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）負(fù)相關(guān)，蔗葉P含量與根系P含量均呈顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）正相關(guān)。

表4 蔗葉N、P、K含量與根系N、P、K含量的關(guān)系Table 4 Relationship between N， P and K content in sugarcane leaves and roots

3 討論

3.1 甘蔗不同器官13C富集情況

前人研究發(fā)現(xiàn)，不同13CO2標(biāo)記植物的13C富集存在較大差異，有的δ13C值處于較高水平，如安婷婷等［10］研 究 發(fā) 現(xiàn)13CO2標(biāo) 記 后 玉 米 莖 和 葉δ13C值 達(dá)1 500‰，尹云鋒等［8］研究發(fā)現(xiàn)13CO2標(biāo)記后水稻葉片δ13C值達(dá)1 400‰，但杉木［15］、小麥與豌豆［16］、互花米草［17］等植物根、莖、葉的δ13C值在13CO2標(biāo)記后仍較低，變化幅度在100.00‰～721.77‰之間，這可能是不同植物之間的差異造成的。前人研究還發(fā)現(xiàn)，葉部δ13C值大于根部［17-19］，這可能與葉片作為光合器官，更易富集13C有關(guān)。本研究中，甘蔗經(jīng)過(guò)6次13CO2脈沖標(biāo)記后，蔗葉和根系δ13C值分別達(dá)到74.5‰～366.2‰和10.6‰～253.6‰，且蔗葉δ13C值大于根部δ13C值，這與前人研究結(jié)果一致［17-19］。

3.2 Na213CO3標(biāo)記濃度、次數(shù)與甘蔗13C富集的關(guān)系

前人研究表明，CO2是作物光合作用的原料，作物13C富集量在很大程度上依賴于該作物生長(zhǎng)期間的大氣13C-CO2［20］，Na213CO3標(biāo)記濃度顯著影響標(biāo)記室內(nèi)12CO2和13CO2的比例，進(jìn)而影響作物13C的富集。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著Na213CO3標(biāo)記濃度的增加，標(biāo)記室內(nèi)Na213CO3與HCl反應(yīng)生產(chǎn)的δ13C-CO2呈線性增加，標(biāo)記結(jié)束后，標(biāo)記室內(nèi)δ13C-CO2下降（表2），同時(shí)蔗葉和根系δ13C值均較未標(biāo)記蔗葉和根系明顯提高，且隨Na213CO3標(biāo)記濃度的增加而增加（圖2），這表明，隨著Na213CO3用量的逐漸增加，13C-CO2濃度的升高促進(jìn)了甘蔗光合同化大氣13CO2的比例，這與前人研究結(jié)果［20］一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，脈沖標(biāo)記結(jié)束后的室內(nèi)CO2濃度雖然下降至551.7～750.5 mg·m-3（表1），但甘蔗光合作用仍正常進(jìn)行，隨著標(biāo)記次數(shù)的增加，T1、T2和T3處理蔗葉δ13C值分別以17.82‰∕次，37.81‰∕次和85.84‰∕次 的 速 率 增 加，F(xiàn)值 分 別 以0.02%∕次、0.041%∕次和0.094%∕次的速率增加。造成該結(jié)果的原因可能是甘蔗屬于C4作物，具有較低的CO2補(bǔ)償點(diǎn)（10 mg·m-3）［21］，因此甘蔗在標(biāo)記結(jié)束后仍具有較強(qiáng)的光合能力，且隨著標(biāo)記次數(shù)和Na213CO3標(biāo)記濃度的增加，蔗葉δ13C值和F值的增加速率均相應(yīng)增加。

3.3 Na213CO3標(biāo)記濃度、次數(shù)與甘蔗標(biāo)記效率的關(guān)系

前人對(duì)不同作物在不同13CO2脈沖標(biāo)記時(shí)間下的標(biāo)記效率已有較多研究，結(jié)果均表明隨著標(biāo)記時(shí)間的不斷增加，作物13C標(biāo)記效率呈先上升后下降的變化規(guī)律。如孫海巖等［22］在玉米苗期利用13C標(biāo)記1 h后，玉米-土壤系統(tǒng)13C同化率達(dá)到76.8%，標(biāo)記結(jié)束30 d后降至34.2%；Bai等［23］利用13CO2脈沖標(biāo)記楊樹的結(jié)果也表明，標(biāo)記6 h后13C回收率為90%，21 d后降低至40%。本研究發(fā)現(xiàn)，每隔7 d進(jìn)行1次標(biāo)記，蔗葉和根系13C的標(biāo)記效率均隨Na213CO3標(biāo)記次數(shù)的增加而增加（表3），其中蔗葉在標(biāo)記14 d（2次）、28 d（4次）和42 d（6次）下的13C標(biāo)記效率分別為1.51%～3.45%、20.19%～32.15%和32.62%～40.74%，這與上述研究結(jié)果相近。但甘蔗標(biāo)記效率在多長(zhǎng)標(biāo)記時(shí)間后開始下降還需進(jìn)一步研究。此外，楊樹標(biāo)記21 d［23］、園林植物標(biāo)記21 d［24］和牧地植物標(biāo)記30 d［25］后，13C標(biāo)記效率處于下降水平，而本研究中甘蔗標(biāo)記效率在42 d（6次）仍處于上升趨勢(shì)，這可能是由于甘蔗是C4作物，具有較高的光合作用水平。

出于成本和標(biāo)記效率考慮，Na213CO3的標(biāo)記濃度和標(biāo)記次數(shù)均應(yīng)在滿足作物13C豐度需求的前提下減少。沈其榮等［26］指出植物δ13C值相差一倍左右即可作為天然材料示蹤天然碳周轉(zhuǎn)動(dòng)態(tài)。Weng等［5］利用δ13C值為16.6‰以上的蔗葉和蔗葉生物炭闡明了蔗葉和蔗葉生物炭還田下植物N吸收的來(lái)源，說(shuō)明δ13C值為16‰以上的蔗葉材料即可滿足研究的需求。本研究中，對(duì)比T1、T2和T3處理下蔗葉δ13C值的增加速率，在T1處理標(biāo)記4次、Na213CO3總用量最少時(shí)即可滿足蔗葉δ13C需求，但該處理下的蔗葉13C標(biāo)記效率（20.19%）較低，因此，如何保證甘蔗低成本投入和13C標(biāo)記高效率產(chǎn)出還需繼續(xù)深入研究和探索。

3.4 13C標(biāo)記與作物N、P、K含量變化的關(guān)系

N、P、K通過(guò)參與碳水化合物的代謝，直接或間接影響光合作用［20］。而大氣CO2濃度升高帶來(lái)的光合作用增強(qiáng)，或植物光合同化CO2過(guò)程中發(fā)生的同位素分餾也可能改變植物的生理代謝過(guò)程，進(jìn)而影響植物體內(nèi)的養(yǎng)分吸收與分配模式［27-28］。前人關(guān)于13C標(biāo)記與作物N、P、K含量變化的關(guān)系還存在一定的爭(zhēng)議。有研究表明植株δ13C值隨葉片N、P、K含量的增加而升高［29］。但也有研究表明，13C標(biāo)記前后植物N含量無(wú)明顯變化［16］。本研究結(jié)果表明，13C標(biāo)記蔗葉的N、K含量顯著高于或相當(dāng)于未標(biāo)記蔗葉，標(biāo)記4次后，P含量在T1和T2處理顯著高于CK處理，這與洪凱等［30］在杉木上的研究結(jié)果一致。原因主要是標(biāo)記引發(fā)的CO2短期加富提高了作物葉片凈光合速率和光能利用效率，從而增強(qiáng)了植物對(duì)養(yǎng)分的吸收能力［30］。標(biāo)記前后CO2以及13C-CO2的變化也進(jìn)一步印證了13C標(biāo)記增強(qiáng)了甘蔗的光合作用這一結(jié)果。標(biāo)記4次后，除T1處理根系的P含量外，標(biāo)記根系的N、P、K含量均整體顯著低于未標(biāo)記根系，N、P、K含量降幅分別為7.9%～32.9%、0.9%～20.7%、21.9%～47.9%。蔗葉與根系N、P、K含量關(guān)系進(jìn)一步表明，除了第4次標(biāo)記的N含量，蔗葉N、K含量與根系N、K含量均呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，蔗葉P含量與根系P含量均呈顯著或極顯著正相關(guān)，說(shuō)明13C標(biāo)記促進(jìn)了甘蔗根系N、K向蔗葉遷移。

4 結(jié)論

在密閉標(biāo)記時(shí)間內(nèi)，外源釋放的13CO295%以上被甘蔗光合作用所利用。蔗葉δ13C值和F值隨標(biāo)記次數(shù)和Na213CO3標(biāo)記濃度的增加而明顯增加?？傮w來(lái)說(shuō)，在甘蔗苗期，每隔7 d標(biāo)記一次，每次采用0.32 g·m-3Na213CO3與HCl反應(yīng)生成13CO2標(biāo)記6 h，共標(biāo)記4次即可獲得經(jīng)濟(jì)適用的13C富集蔗葉。13C脈沖標(biāo)記影響了甘蔗體內(nèi)N、P、K的吸收與分配，促進(jìn)了根系N、K向蔗葉遷移。