王現(xiàn)生，于紅艷，郭小燕 (河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥二科，河北 邯鄲 056000)

肺癌是嚴(yán)重威脅人類生命的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與病死率均居惡性腫瘤首位[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要組織學(xué)類型，占所有肺癌的80%～85%，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，NSCLC的早期診斷和治療已取得進(jìn)展，然而NSCLC患者5年生存率仍然較低[2]。研究與NSCLC臨床病理特征及預(yù)后有關(guān)的因子有助于發(fā)現(xiàn)有效的生物標(biāo)記物，以減少NSCLC患者預(yù)后不良的發(fā)生。三重基序蛋白(tripartite motif protein，TRIM)參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、免疫、癌癥發(fā)生等多種細(xì)胞生物學(xué)過程，其中TRIM59與NSCLC的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān)[3]。p53是一種抑癌基因，野生型p53能夠通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑癌作用；在所有惡性腫瘤中，50%以上會(huì)出現(xiàn)p53基因的突變，p53基因突變后，其空間構(gòu)象也發(fā)生改變，使其失去對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和DNA修復(fù)的調(diào)控作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[4-5]。另有研究顯示，TRIM59、p53可共同影響順鉑在食管癌細(xì)胞中的敏感性[6]。但目前關(guān)于TRIM59與p53聯(lián)合作用在NSCLC組織中的表達(dá)情況尚不明確，因此本研究通過分析NSCLC組織及癌旁組織中TRIM59、p53的表達(dá)，探討二者與NSCLC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選取2014年5月至2016年5月在我院診斷為NSCLC的73例患者為研究對(duì)象，其中男41例，女32例；年齡30～81歲，平均(63.25±8.69)歲；有吸煙史47例，無吸煙史26例；鱗癌31例，腺癌38例，其他4例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為NSCLC；②在我院進(jìn)行手術(shù)治療，且癌組織及癌旁組織齊全；③術(shù)前未進(jìn)行放化療；④一般資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心、肝、腎等嚴(yán)重疾??；②患有自身免疫性疾??；③合并其他惡性腫瘤。根據(jù)國際肺癌研究協(xié)會(huì)公布的第八版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[7]對(duì)NSCLC患者進(jìn)行臨床分期，其中Ⅰ期21例，Ⅱ期36例，Ⅲ期16例。根據(jù)WHO肺癌病理學(xué)分類對(duì)患者進(jìn)行分級(jí)，其中低分化23例，中分化34例，高分化16例。

通過電話或門診復(fù)查的方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，記錄患者生存狀態(tài)。隨訪60個(gè)月，隨訪截止日期為2021年7月30日，患者死亡日期或隨訪截止日期作為終點(diǎn)事件時(shí)間。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗人TRIM59蛋白(批號(hào)：ab69639)、p53蛋白(批號(hào)：ab32389)單抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔lgG(批號(hào)：ab150077)購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；DAB顯色試劑盒(批號(hào)：ZLI-9017)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑盒購自上海通蔚生物有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上?？泼羯锟萍加邢薰?。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TRIM59、p53蛋白表達(dá)

NSCLC組織及癌旁組織常規(guī)石蠟包埋保存。經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、封閉后加入兔抗人TRIM59、p53蛋白單抗，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔lgG(稀釋比1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，加入DAB顯色試劑盒進(jìn)行染色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精短暫分化后脫水、透明、封片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：由2名具有5年以上工作經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師根據(jù)雙盲法對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量評(píng)分，以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕色顆粒為陽性。采用染色指數(shù)(stain index，SI)進(jìn)行評(píng)分，SI=陽性細(xì)胞率評(píng)分×陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分，其中SI≤3分為陰性，SI>3分為陽性。陽性細(xì)胞率評(píng)分：無陽性細(xì)胞記為0分，陽性細(xì)胞率<25%記為1分,陽性細(xì)胞率為25%～50%記為2分,陽性細(xì)胞率為51%～75%記為3分,陽性細(xì)胞率>75%記為4分。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無染色為0分，淺黃色為1分，黃褐色為2分，棕褐色為3分。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)TRIM59、p53 mRNA表達(dá)

按照TRIzol試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。TRIM59 mRNA以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR反應(yīng)，p53 mRNA以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物序列見表1。具體反應(yīng)條件為：95 ℃、2 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、15 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算出TRIM59、p53 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織及癌旁組織中TRIM59、p53蛋白的表達(dá)

NSCLC組織中TRIM59蛋白陽性表達(dá)率為 74.0%(54/73)，高于癌旁組織的9.6%(7/73)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=62.201，P<0.001)。NSCLC組織中p53蛋白陽性表達(dá)率為65.8%(48/73)，高于癌旁組織的5.5%(4/73)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=55.859，P<0.001)，見圖1。

a：TRIM59蛋白在癌旁組織中的表達(dá)；b：TRIM59蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)；c：p53蛋白在癌旁組織中的表達(dá)；d：p53蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)圖1 TRIM59、p53蛋白在癌旁組織及NSCLC組織中的表達(dá)(×200)

2.2 NSCLC組織及癌旁組織中TRIM59 mRNA、p53 mRNA的表達(dá)

與癌旁組織比較，NSCLC組織中TRIM59、p53 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 NSCLC組織及癌旁組織中TRIM59、p53 mRNA的表達(dá)

2.3 TRIM59及p53蛋白表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

NSCLC組織中TRIM59蛋白陽性表達(dá)54例，陰性表達(dá)19例；p53蛋白陽性表達(dá)48例，陰性表達(dá)25例。NSCLC組織中TRIM59、p53蛋白陽性表達(dá)與患者的年齡、性別、吸煙史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類型無關(guān)(P>0.05)，與患者的TNM分期、組織分化有關(guān)(P<0.05)，見表3。

表3 TRIM59、p53蛋白表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.4 NSCLC組織中TRIM59 mRNA與p53 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

NSCLC組織中TRIM59 mRNA表達(dá)與p53 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.360，P=0.002)，見圖2。

圖2 NSCLC組織中TRIM59 mRNA與p53 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

2.5 TRIM59、p53蛋白表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

采用TCGA數(shù)據(jù)庫分析TRIM59、p53蛋白與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系，共納入494例，其中TRIM59高表達(dá)125例，TRIM59低表達(dá)369例，p53高表達(dá)124例，p53低表達(dá)370例。結(jié)果顯示，TRIM59高表達(dá)患者與低表達(dá)患者的預(yù)后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，p53高表達(dá)患者與低表達(dá)患者的預(yù)后比較差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫分析TRIM59、p53蛋白與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

對(duì)NSCLC患者進(jìn)行隨訪，5年內(nèi)共有46例患者死亡，生存率為37.0%。TRIM59蛋白陽性表達(dá)患者5年生存率(31.5%)低于陰性表達(dá)患者(52.6%)；p53蛋白陽性表達(dá)患者5年生存率(29.2%)低于陰性表達(dá)患者(52.0%)，見圖4。

圖4 Kaplan-Meier法分析TRIM59蛋白、p53蛋白與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

2.6 COX回歸分析影響NSCLC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

單因素COX分析表明，年齡、吸煙史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、組織分化、TRIM59蛋白表達(dá)、p53蛋白表達(dá)均是影響NSCLC患者預(yù)后的因素(P<0.05)，見表4；多因素COX分析表明，TNM Ⅲ期、低分化、TRIM59蛋白陽性表達(dá)、p53蛋白陽性表達(dá)均是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.001)，見表5。

表4 影響NSCLC患者預(yù)后的單因素COX分析

表5 影響NSCLC患者預(yù)后的多因素COX分析

3 討論

肺癌是原發(fā)于氣管、支氣管和肺部的惡性腫瘤，主要包括小細(xì)胞肺癌、肺鱗癌、肺腺癌和大細(xì)胞肺癌幾種類型。隨著人們生活方式及習(xí)慣的改變，肺癌的發(fā)生率逐漸升高，嚴(yán)重威脅人類健康。目前肺癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，吸煙、飲食、遺傳、空氣污染、職業(yè)等因素均與肺癌的發(fā)生有關(guān)。臨床主要根據(jù)患者腫瘤病理類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等對(duì)患者進(jìn)行針對(duì)性治療。臨床分期和組織分化是肺癌患者重要的臨床病理特征，是影響肺癌患者預(yù)后的重要因素。進(jìn)一步明確與NSCLC有關(guān)的臨床病理特征，可能對(duì)改善NSCLC患者不良預(yù)后具有重要意義。

TRIM蛋白由一系列高度保守的基序蛋白組成，這些蛋白含有RING結(jié)構(gòu)域、B-box基序及一個(gè)卷曲螺旋區(qū)域[8]。大多TRIM蛋白是E3泛素連接酶，能夠促進(jìn)各種底物的翻譯后修飾，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、凋亡、炎癥等過程[9]。TRIM59蛋白表達(dá)不僅與腫瘤細(xì)胞的惡性行為有關(guān)，也與腫瘤患者的臨床病理特征有一定關(guān)系。Han等[10]研究表明，TRIM59通過影響B(tài)ECN1的轉(zhuǎn)錄和泛素化在NSCLC的自噬調(diào)節(jié)中起重要作用。Ying等[11]研究表明，在肝細(xì)胞癌組織中TRIM59表達(dá)上調(diào)，TRIM59可通過降解蛋白磷酸酶1B促進(jìn)肝細(xì)胞癌的腫瘤生長(zhǎng)并調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。本研究結(jié)果表明，NSCLC組織中TRIM59蛋白陽性表達(dá)率、TRIM59 mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，且TRIM59蛋白陽性表達(dá)與NSCLC患者的TNM分期、組織分化有關(guān)，提示TRIM59蛋白與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，原因可能是TRIM59可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖及遷移，進(jìn)而影響NSCLC的發(fā)生發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)，TRIM59蛋白陽性表達(dá)NSCLC患者的5年生存率顯著低于陰性表達(dá)患者，且COX回歸分析表明TRIM59蛋白陽性表達(dá)是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示TRIM59可能是NSCLC預(yù)后的預(yù)測(cè)因子和潛在的治療靶標(biāo)。

抑癌基因p53可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、衰老及細(xì)胞周期等生物學(xué)過程在預(yù)防腫瘤的發(fā)生中起關(guān)鍵作用[12]。韓璐等[13]研究表明，胃癌組織中p53陽性表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織中p53蛋白陽性表達(dá)率、p53 mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，且p53蛋白陽性表達(dá)與患者的TNM分期及組織分化有關(guān)，提示p53蛋白表達(dá)與NSCLC的發(fā)生及臨床病理特征有關(guān)，這可能是由于突變型p53蛋白與野生型p53蛋白結(jié)合，導(dǎo)致野生型p53蛋白抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力減弱，半衰期增加，因此NSCLC組織中p53蛋白陽性率高于癌旁組織[14]。本研究對(duì)患者進(jìn)行了5年隨訪，結(jié)果表明p53蛋白陽性表達(dá)患者5年生存率低于陰性表達(dá)患者；COX回歸分析顯示，p53蛋白陽性表達(dá)是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示p53蛋白可能與NSCLC患者的預(yù)后有關(guān)，與以往研究結(jié)果一致[15-16]。但是本研究結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果不一致，TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示，TRIM59、p53高表達(dá)患者與低表達(dá)患者的預(yù)后情況比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是由于數(shù)據(jù)庫分析樣本較多，人群不同，而本研究樣本量較小，且為單中心研究，故研究結(jié)果還有待深入分析。

Liu等[6]研究表明，阻斷TRIM59可通過上調(diào)p53而增強(qiáng)食管癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性。但是NSCLC患者組織中TRIM59與p53的關(guān)系目前尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC細(xì)胞系中TRIM59蛋白呈高表達(dá)趨勢(shì)，而敲除TRIM59后p53蛋白表達(dá)水平無顯著變化，因此該研究認(rèn)為TRIM59可能通過DNA合成后期，逐漸進(jìn)入分裂期，而不是通過影響p53信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移[3]。本研究對(duì)NSCLC患者組織中TRIM59、p53 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明二者表達(dá)呈正相關(guān)，說明TRIM59 mRNA與p53 mRNA可能共同參與NSCLC進(jìn)展過程，但具體的內(nèi)在機(jī)制還需深入分析。

綜上所述，TRIM59、p53蛋白表達(dá)與NSCLC患者TNM分期、組織分化及預(yù)后有關(guān)，二者可能通過某一機(jī)制影響NSCLC患者的發(fā)展及預(yù)后。但本研究?jī)H對(duì)NSCLC組織及癌旁組織TRIM59、p53蛋白和mRNA表達(dá)進(jìn)行了分析，還需通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證二者在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用。