張峻崢，謝偉偉，樊 宏 (中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院耳鼻咽喉科，海南 ?？?570208)

鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽上皮細胞的高度惡性腫瘤，其在我國南方發(fā)病率較高，該疾病在早期進展時伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，但無明顯癥狀，故而超過70%的鼻咽癌患者確診時已處于晚期，使得治療難度增加，病死率較高[1-2]。目前，放療及其相關(guān)綜合治療策略的實施使鼻咽癌患者的5年生存率提高至了85%左右，有效延長了患者生存期[3]。但部分患者局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移引起的放療抵抗仍然是鼻咽癌臨床治療的難點[4]。研究鼻咽癌放療增敏相關(guān)的作用機制及靶點，增加鼻咽癌患者放療敏感性，對于提高鼻咽癌的臨床療效具有重要意義。泛素結(jié)合酶E2T(ubiquitin-conjugating enzyme E2T，UBE2T)是泛素結(jié)合酶家族成員之一，屬于泛素-蛋白酶系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[5]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，UBE2T參與細胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及腫瘤放療抵抗等過程，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[6]。胡威[7]檢測發(fā)現(xiàn)，UBE2T蛋白在鼻咽癌組織中表達升高，且其表達水平與鼻咽癌患者惡性特征及不良預后相關(guān)，是鼻咽癌預后不良的獨立危險因素。鄭志剛等[8]研究發(fā)現(xiàn)，干擾UBE2T表達可促進鼻咽癌細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。但UBE2T在鼻咽癌放療敏感性中的作用及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導機制尚未見報道。本研究旨在探討UBE2T對鼻咽癌細胞放療敏感性的影響，并分析相關(guān)分子機制，以期為鼻咽癌的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

人鼻咽癌細胞CNE2和正常鼻咽上皮細胞NP69購自通派(上海)生物科技有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibico公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自日本Takara公司；TRIzol試劑、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；UBE2T小干擾RNA序列(UBE2T-siRNA)及其陰性對照序列(NC-siRNA)購自上海吉瑪公司；CCK-8試劑盒購自北京利維寧生物科技有限公司；RIPA細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；ECL試劑盒購自南京川博生物技術(shù)有限公司;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；兔抗Wnt3α、β-catenin、c-myc單克隆抗體，鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate behydrogenase,GAPDH)單克隆抗體購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔IgG(H+L)抗體、山羊抗鼠IgG(H+L)抗體購自美國KPL公司。HM-SY96S酶標分析儀購自山東恒美電子科技有限公司；Herocell 180二氧化碳細胞培養(yǎng)箱購自上海潤度生物科技有限公司；DYCP-32B型電泳儀購自北京六一生物科技有限公司；ViPlex Fluor實時熒光定量PCR儀購自锘海生物科學儀器(上海)有限公司；M20R低溫高速離心機購自上海邁皋科學儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；FCM凝膠成像儀購自美國Protein Simple公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人鼻咽癌CNE2細胞在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，NP69細胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，RPMI 1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基中均添加10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞分組與轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的CNE2細胞，以每孔3×104/mL的密度接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)，待細胞貼壁后，將細胞分為Control組(常規(guī)培養(yǎng))、NC-siRNA組(轉(zhuǎn)染NC-siRNA)、UBE2T-siRNA組(轉(zhuǎn)染UBE2T-siRNA)、放療組(采用6 MV X射線按照4 Gy照射劑量照射5 min)、NC-siRNA+放療組(轉(zhuǎn)染NC-siRNA后采用6 MV X射線按照4 Gy照射劑量照射5 min)、UBE2T-siRNA+放療組(轉(zhuǎn)染UBE2T-siRNA后采用6 MV X射線按照4 Gy照射劑量照射 5 min)。轉(zhuǎn)染過程嚴格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行， 細胞轉(zhuǎn)染48 h后，采用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 qRT-PCR檢測細胞中UBE2T mRNA表達水平 收集常規(guī)培養(yǎng)的CNE2細胞、NP69細胞以及經(jīng)過轉(zhuǎn)染處理的CNE2細胞，采用TRIzol法提取細胞內(nèi)總RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書進行擴增。UBE2T上游引物序列：5’-TTGATTCTGCTGGAAGGATTTG-3’，下游引物序列：5’-AGTTGCGATGTTGAGGGAT-3’；GAPDH上游引物序列：5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’，下游引物序列：5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。反應(yīng)體系(10 μL體系)：稀釋后的cDNA模板1 μL，qRT-PCR試劑5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 60 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，共進行40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。實驗重復3次。

1.2.4 CCK-8檢測細胞增殖能力 將各組CNE2細胞重懸為2×105/mL的細胞懸液，按每孔100 μL的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，采用酶標儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度(A)值。實驗過程中每組設(shè)置3個平行孔，實驗重復3次。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況 收集各組CNE2細胞懸液，用PBS洗滌2次，加入5 μL Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，加入5 μL PI染色液，輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，于1 h內(nèi)采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.2.6 Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達 收集各組CNE2細胞懸液，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，以SDS-PAGE進行分離，濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入Wnt3α(1∶1 000)、β-catenin(1∶800)、c-myc(1∶800)、GAPDH(1∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜，加入HRP標記的山羊抗兔IgG(H+L)、山羊抗鼠IgG(H+L)二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h后，采用ECL試劑盒顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，目的蛋白相對表達量用目的蛋白灰度值比內(nèi)參蛋白灰度值表示。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 CNE2細胞和NP69細胞中UBE2T表達比較

CNE2細胞中UBE2T mRNA表達水平顯著高于NP69細胞(P<0.05)，見圖1。

*：與NP69細胞比較，P<0.05

2.2 轉(zhuǎn)染UBE2T-siRNA后CNE2細胞中UBE2T的表達

與Control組比較，NC-siRNA組細胞中UBE2T mRNA表達水平無明顯變化(P>0.05)，而UBE2T-siRNA組細胞中UBE2T mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖2。

*：與Control組比較，P<0.05圖2 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染UBE2T-siRNA后CNE2細胞中UBE2T的表達

2.3 干擾UBE2T表達及聯(lián)合放療對CNE2細胞增殖的影響

與Control組比較，NC-siRNA組細胞增殖活性無明顯變化(P>0.05)，放療組、UBE2T-siRNA組細胞增殖活性均顯著降低(P<0.05)；與放療組比較，NC-siRNA+放療組細胞增殖活性無明顯變化(P>0.05)，UBE2T-siRNA+放療組細胞增殖活性顯著降低(P<0.05)；且UBE2T-siRNA+放療組細胞增殖活性顯著低于UBE2T-siRNA組(P<0.05)，見圖3。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與放療組比較，P<0.05；△：與UBE2T-siRNA組比較，P<0.05圖3 干擾UBE2T表達及聯(lián)合放療對CNE2細胞增殖的影響

2.4 干擾UBE2T表達及聯(lián)合放療對CNE2細胞凋亡的影響

與Control組比較，NC-siRNA組細胞凋亡率無明顯變化(P>0.05)，放療組、UBE2T-siRNA組細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)；與放療組比較，NC-siRNA+放療組細胞凋亡率無明顯變化(P>0.05)，UBE2T-siRNA+放療組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；且UBE2T-siRNA+放療組細胞凋亡率顯著高于UBE2T-siRNA組(P<0.05)，見圖4。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與放療組比較，P<0.05；△：與UBE2T-siRNA組比較，P<0.05

2.5 干擾UBE2T表達及聯(lián)合放療對CNE2細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

與Control組比較，NC-siRNA組細胞中Wnt3α、β-catenin、c-myc蛋白表達無明顯變化(P>0.05)，放療組、UBE2T-siRNA組細胞中Wnt3α、β-catenin、c-myc蛋白表達均顯著降低(P<0.05)；與放療組比較，NC-siRNA +放療組細胞中Wnt3α、β-catenin、c-myc蛋白表達無明顯變化(P>0.05)，UBE2T-siRNA+放療組細胞中Wnt3α、β-catenin、c-myc蛋白表達均顯著降低(P<0.05)；且UBE2T-siRNA+放療組細胞中Wnt3α、β-catenin、c-myc蛋白表達均顯著低于UBE2T-siRNA組(P<0.05)，見圖5。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與放療組比較，P<0.05；△：與UBE2T-siRNA組比較，P<0.05

3 討論

UBE2T最早是在范可尼貧血DNA修復損傷過程的相關(guān)研究中被發(fā)現(xiàn)，定位于染色體1q32.1上，具有一個大小為16～18 kDa特征性的保守結(jié)構(gòu)域-泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。UBE2T不僅在細胞增殖過程中起重要作用，在FANCD2單泛素化和基因組完整性方面也發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。還有研究發(fā)現(xiàn)，UBE2T在多種腫瘤組織中高表達并可促進腫瘤進程，提示UBE2T在惡性腫瘤表型中有一定作用，是一種重要的癌基因[10]。Hao等[11]發(fā)現(xiàn)，UBE2T在腎細胞癌組織中表達顯著上調(diào)，且與腫瘤病理分期晚、分級高及預后不良呈顯著相關(guān)性,敲除UBE2T基因可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路抑制腎細胞癌細胞增殖。Liu等[12]的研究顯示，UBE2T在膽管癌組織和細胞系中表達上調(diào)，并參與膽管癌惡性進展，UBE2T可能通過調(diào)控mTOR途徑的活性影響膽管癌細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示，鼻咽癌CNE2細胞中UBE2T表達水平顯著高于正常鼻咽上皮NP69細胞，干擾UBE2T表達可降低CNE2細胞增殖活性，提高細胞凋亡率，提示UBE2T高表達可能是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的主要因素，其在鼻咽癌中發(fā)揮促癌作用。

放療及以其為主的綜合治療是鼻咽癌等頭頸部腫瘤目前公認的有效治療措施。近年來，隨著放療技術(shù)的不斷發(fā)展與進步，鼻咽癌的放療效果不斷提高，但由于腫瘤遺傳特性改變、惡性腫瘤組織對放療的敏感性差異等因素，放療過程中腫瘤逐漸適應(yīng)相應(yīng)理化環(huán)境的改變，產(chǎn)生放療抵抗效應(yīng)，導致腫瘤局部復發(fā)或轉(zhuǎn)移，進而影響放療效果[13]。因此，尋找放療敏感性相關(guān)生物標志物以提高放療敏感性對改善腫瘤放療效果至關(guān)重要。Sun等[14]研究發(fā)現(xiàn)，UBE2T調(diào)節(jié)的H2AX單基因通過誘導CHK1激活促進肝細胞性肝癌的放療抗性。Shen等[15]的研究顯示，下調(diào)UBE2T聯(lián)合放療在體內(nèi)外均能明顯抑制骨肉瘤細胞的克隆形成和遷移，并促進骨肉瘤細胞的凋亡，提示UBE2T下調(diào)可提高骨肉瘤的放療敏感性。本研究結(jié)果顯示，干擾UBE2T表達聯(lián)合放療可顯著降低CNE2細胞增殖活性，提高細胞凋亡率。提示UBE2T參與鼻咽癌放療抵抗的形成，并提高鼻咽癌細胞的放療抗性。

Wnt/β-catenin信號通路是腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡的關(guān)鍵通路。β-catenin是一種多功能細胞骨架蛋白，亦是Wnt信號轉(zhuǎn)導通路中的關(guān)鍵信號分子，當Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路被激活時，Wnt分泌蛋白穿過細胞膜與相應(yīng)受體結(jié)合，經(jīng)過多次生物信號傳遞過程抑制β-catenin的磷酸化降解，使β-catenin大量累積并進一步轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)，與T細胞因子/淋巴增強因子形成轉(zhuǎn)錄復合物，啟動下游c-myc等靶基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移過程[16-17]。異常激活的Wnt/β-catenin信號通路可能是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的重要機制之一[18]。UBE2T可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路影響腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移[19]。為了明確UBE2T與Wnt/β-catenin信號通路在鼻咽癌中的關(guān)系，本研究檢測了Wnt/β-catenin信號通路主要相關(guān)蛋白的變化，結(jié)果顯示，干擾UBE2T表達顯著下調(diào)Wnt3α、β-catenin、c-myc蛋白表達，提示UBE2T通過激活Wnt/β-catenin信號通路影響鼻咽癌細胞的增殖和凋亡。有研究報道，Wnt/β-catenin信號通路基因多態(tài)性與鼻咽癌放療效果和毒性具有相關(guān)性[20]。本研究進一步探究干擾UBE2T聯(lián)合放療對鼻咽癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達的影響，結(jié)果顯示，UBE2T-siRNA+放療組細胞中Wnt3α、β-catenin、c-myc蛋白表達均顯著低于放療組和UBE2T-siRNA組，表明干擾UBE2T表達可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路活性從而增強鼻咽癌細胞的放療敏感性。

綜上所述，UBE2T在鼻咽癌細胞中高表達，干擾UBE2T表達可抑制鼻咽癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，并增強鼻咽癌細胞的放療敏感性，其作用機制與調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路活性相關(guān)。因此，靶向抑制UBE2T有望提高鼻咽癌患者對放療的敏感性，改善鼻咽癌患者的臨床療效和預后。