周玉照，張小苗*，柴 俊

（1.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 大理 671003；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明）

豬圓環(huán)病毒（PCV）根據(jù)其基因型的不同，目前分為 PCV-1、PCV-2、PCV-3及 PCV-4等 4種血清型[1-2]。而 PCV-1不致病，PCV-2是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病（PCVAD）的主要病原，PCV-3是一種與豬生殖功能衰竭、皮炎和腎病綜合征和多系統(tǒng)炎癥相關(guān)的新型圓環(huán)病毒[3]。PCV-2全基因組有1766～1768個(gè)核苷酸，其中ORF2基因編碼的 Cap蛋白是 PCV-2主要免疫原性蛋白，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，此外，ORF2還常用于PCV-2的流行病學(xué)分析[4]。因PCV-2在世界范圍內(nèi)的廣泛流行，使得PCV-2流行毒株的基因亞型相繼發(fā)生突變，給豬圓環(huán)病毒病的防治和疫苗研發(fā)帶來了困難[5]。因此，對(duì)云南 PCV-2流行毒株進(jìn)行分析很有必要。筆者從云南不同地區(qū)采集的疑似PCV-2 43份樣品先進(jìn)行PCV-2病原學(xué)檢測(cè)，再對(duì)陽性病料進(jìn)行全基因測(cè)序，利用生物軟件對(duì)獲得的核苷酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析，同時(shí)對(duì)獲得的ORF2基因序列編碼的Cap蛋白與5株疫苗株Cap蛋白作抗原指數(shù)差異性比較，從而弄清云南省豬場(chǎng)中PCV-2的基因型及其變異情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 從云南省不同地區(qū)發(fā)病豬場(chǎng)，采集臨床癥狀疑似豬圓環(huán)病的發(fā)病豬全血 41份和2份公豬精液，共43份。

1.1.2 主要試劑 rTaq酶、Taq Buffer、ddH2O、大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞、Magen DNA提取試劑盒、pMDl9-T載體、DNA Marker DL-2000，均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA膠回收試劑盒購自昆明錦昂科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參考 GenBank里的PCV-2基因序列（GenBank登錄號(hào)為 KJ 437192.1），利用生物軟件分別設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增PCV-2-ORF2基因和PCV-2全基因的引物。引物序列 PCV-2-ORF2F 5′-ATGACGTATCCAAGGAG GC-3′，PCV-2-ORF2R 5′-TTAGGGTTTAAGTGG GGGGT-3′；PCV-2-F 5′-ATCCACGGAGGAAGG GGGCCAGTT-3′，PCV-2-R 5′-GTGGATTGTTCT GT AGCATTCTTCCA-3′。引物由寶生物（大連）有限公司合成。

1.2.2 PCR鑒定 用DNA提取試劑盒提取43份病料的總DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCV-2-ORF2基因，大小約702 bp，PCR擴(kuò)增體系：上下游引物各 0.5 μl，10×Taq Buffer 3 μl，dNTP 2.5 μl，rTaq 0.5 μl，DNA 2 μl，ddH2O 21 μl。PCR 擴(kuò)增程序：預(yù)變性 95 ℃ 4 min；變性 95 ℃ 40 s，退火55 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 55 s，32個(gè)循環(huán)；終延伸72 ℃ 5 min。

1.2.3 PCV-2全基因PCR擴(kuò)增及克隆 將陽性病料的DNA為模板，以引物PCV-2-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增 PCV-2全基因片段，大小約 1 768 bp。將目的片段膠回收純化后進(jìn)行陽性克隆，并挑選出陽性克隆的菌落并進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4 PCV-2全基因序列測(cè)定及分析 將陽性克隆重組質(zhì)粒菌液送寶生物有限公司進(jìn)行全基因測(cè)序，應(yīng)用生物軟件進(jìn)行PCV-2蛋白質(zhì)氨基酸同源性比對(duì)、遺傳進(jìn)化分析、PCV-2 Cap蛋白氨基酸比對(duì)和Cap蛋白抗原指數(shù)預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR鑒定

將PCV-2-ORF2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，約702 bp處出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的片段（圖1）。

圖1 PCV-2-ORF2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 PCV-2全基因PCR擴(kuò)增

將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，約 1768 bp處出與預(yù)期大小相符的片段（圖2）。

圖2 PCV-2全基因擴(kuò)增結(jié)果

2.3 PCV-2全基因序列測(cè)定及分析

2.3.1 PCV-2蛋白氨基酸比對(duì)與遺傳進(jìn)化分析將從公豬精液病料中測(cè)序得到的序列命名為 YN PCV2-1，從病豬全血病料中測(cè)序得到的序列分別命名為YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-4、YN PCV2-5。用DNAStar中的MegAlign軟件與國(guó)內(nèi)外PCV-2進(jìn)行氨基酸比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，YN PCV2-1氨基酸同源性在82.0 %～99.1 % 之間；YN PCV2-2氨基酸同源性在81.5 %～99.1 % 之間；YN PCV2-3氨基酸同源性在 66.8 %～84.5 % 之間；YN PCV2-4氨基酸同源性在 83.3 %～98.7 % 之間；YN PCV2-5氨基酸同源性在 79.0 %～93.6 % 之間；YN PCV2-4氨基酸遺傳進(jìn)化分型上與PT-27168-08.HQ831537毒株屬于同一個(gè)分支，親緣關(guān)系近。YN PCV2-1、YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-5 與其他毒株不屬于同一個(gè)分支（圖3）。

圖3 PCV-2蛋白氨基酸遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

2.3.2 PCV-2 Cap蛋白氨基酸比對(duì)分析 用MegAlign軟件分別將 YN PCV2-1、YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-4、YN PCV2-5 的ORF2基因與國(guó)內(nèi)外分離株、疫苗株（AY686764 ZJ、GU049340 1010、HM038027 SH、HM 038034 LG、KX161697 YZ）進(jìn)行氨基酸比對(duì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)YN PCV2-5 Cap蛋白氨基酸變化最明顯，有8個(gè)氨基酸位點(diǎn)出現(xiàn)變異；獲得的5株Cap蛋白氨基酸都出現(xiàn)的位點(diǎn)為 25位 F→V，4株Cap蛋白氨基酸都出現(xiàn)的位點(diǎn)為11位K→F、217位A→V、223位M→T，3株Cap蛋白氨基酸都出現(xiàn)的位點(diǎn)為187位G→E/V，25氨基酸位點(diǎn)突變頻率最高，其次是 11位、217位、223位，詳細(xì)結(jié)果見表1。

表1 PCV-2 Cap蛋白氨基酸變異位點(diǎn)比對(duì)分析結(jié)果

2.3.3 PCV-2 Cap 蛋白抗原指數(shù)預(yù)測(cè)分析 應(yīng)用Protean軟件中的 Antigenicity-Jameson-Wolf分析YN PCV2-1、YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-4、YN PCV2-5的Cap蛋白抗原指數(shù)并與5株疫苗株（AY686764 ZJ、GU049340 1010、HM038027 SH、HM038034 LG、KX161697 YZ）的 Cap蛋白抗原指數(shù)進(jìn)行差異性分析。結(jié)果 YN PCV2-4 Cap蛋白抗原指數(shù)與 5株疫苗株的 Cap蛋白抗原指數(shù)差異性不大，而 YN PCV2-1、YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-5的 Cap蛋白抗原指數(shù)與5株疫苗株的Cap蛋白抗原指數(shù)差異性較大，其中在 5～10，25，40～50，70，172～176，210～223區(qū)域的抗原指數(shù)均不同于疫苗株（圖4）。

圖4 PCV-2 Cap蛋白抗原指數(shù)預(yù)測(cè)分析結(jié)果

3 討論

目前，豬圓環(huán)病毒 2型是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的疾病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6]。疫苗免疫接種是預(yù)防 PCV的主要手段，但目前豬場(chǎng)普遍存在免疫失敗的情況，而引起免疫失敗的原因有很多，主要包括免疫程序、疫苗品質(zhì)、存在免疫抑制性疾病、豬場(chǎng)管理等方面的原因[7]。在不同規(guī)模的豬場(chǎng)、采取的生物安全措施也各有差異，所以PCV-2感染率也不一樣[8]。

在云南省福貢縣和花益[9]等報(bào)道農(nóng)村散養(yǎng)戶PCV-2感染率為 59 %；2016年宋春蓮[10]等在云南地區(qū)部分種豬場(chǎng)檢測(cè)出 PCV-2的陽性為28.71 %；2018年李金鳳[11]等在云南省思茅地區(qū)豬場(chǎng)蚊 PCV-2檢測(cè)，其陽性率為 15.96 %，2021年李枝蘭[12]等在云南不同地區(qū)成功分離到 2株P(guān)CV-2分離毒株?？梢奝CV-2感染已經(jīng)成為影響云南養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一。而與云南相領(lǐng)的省份也相繼報(bào)道有PCV-2的感染，2018年李海全[13]等在四川省部分地區(qū)檢測(cè)出 PCV-2的陽性為49.2 %；2018年吳好葉[14]等在貴州省獲得了 16株 PCV-2的流行株；2018年呂其壯[15]等在廣西北部灣地區(qū)檢測(cè)出 PCV-2的陽性為 42.16 %，李金鳳[16]從豬場(chǎng)蚊子體中檢測(cè)到 PCV2，而且存在PCV2a、PCV2b和 PCV2d 3種亞型，其中PCV2d為主要的基因型。試驗(yàn)從云南各地區(qū)采集疑似病料 43份，并從中檢測(cè)出 5株云南流行PCV-2毒株，其陽性率為 11.63 %，說明云南省PCV-2普遍存在；獲得的Cap蛋白氨基酸多處出現(xiàn)突變，Cap蛋白抗原指數(shù)與 5株疫苗株存在較大的差異性，多個(gè)區(qū)域都與疫苗株不相同，說明云南省流行的PCV-2毒株與商品疫苗毒株存在差異，如果養(yǎng)殖場(chǎng)用商品化疫苗進(jìn)行免疫接種預(yù)防豬圓環(huán)病毒 2型，可能預(yù)防效果會(huì)大大降底甚至起不到任何作用，這給云南省PCV-2的防控帶來很大難度。

4 結(jié)論

云南省普遍存在PCV-2的流行，且流行毒株與目前常用的商品化疫苗毒株相比基因發(fā)生了突變。對(duì)于云南養(yǎng)豬業(yè)來說要引起高度注視，而目前做好養(yǎng)殖廠生物安全是防控該病的最有效手段。