楊玉玲，吳愫青

（珠海市食品藥品檢驗所，廣東 519000）

國際上抗生素效價測定以管碟法和濁度法并行，濁度法具有耗時短、靈敏度高、操作簡單、人為影響因素少、測定結果準確度與精密度高的優(yōu)點，《中國藥典》自2005年版已收載濁度法。本文對紅霉素效價測定的濁度法和管蝶法進行了相關試驗，進一步比較管碟法、濁度法測定過程中的優(yōu)缺點和影響因素。

1 材料與儀器

1.1 材料 金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、紅霉素標準品（批號130307-201417，效價928 U/mg，由中國食品藥品檢定院提供）；紅霉素腸溶片（批號11200203、11190308，來源于特一藥業(yè)集團有限公司；批號190701，來源于廣東華南藥業(yè)集團有限公司）；紅霉素腸溶膠囊（批號190104，來源于浙江華潤三九眾益制藥有限公司）；依托紅霉素片（批號11190604、11181203，來源于特一藥業(yè)集團有限公司）；琥乙紅霉素片（批號2102035020，來源于西安利君制藥有限責任公司；批號A2105003，來源于石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司；批號A21100903，來源于浙江京新藥業(yè)股份有限公司）；依托紅霉素顆粒（批號211101，來源于湖北東信藥業(yè)有限公司）；抗生素檢定培養(yǎng)基3號（批號1100031，由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供）；氯化鈉（批號20161012，來源于天津市百世化工有限公司）；磷酸二氫鉀（批號20180226，來源于天津市大茂化學試劑廠）；磷酸氫二鉀（批號20151001-11，來源于廣州化學試劑廠）。

1.2 儀器WBS-100微生物比濁法測定儀（北京先驅威鋒技術開發(fā)公司）；ZY-300IV多功能微生物自動測量分析儀（北京先驅威鋒技術開發(fā)公司）；Sartorius CPA225D十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；Zealway GR110DR高壓滅菌鍋（致微儀器有限公司）；DHG-9123A恒溫干燥箱（上海申賢恒溫設備廠）；量瓶、培養(yǎng)皿、移液管、刻度吸管。

2 方法

2.1 金黃色葡萄球菌菌懸液的制備 取金黃色葡萄球菌凍干菌1支，于生物安全柜內操作，用滅菌的0.9%氯化鈉溶液適量將凍干菌溶解并轉移至營養(yǎng)瓊脂斜面上，于36℃培養(yǎng)26 h。再取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，于36℃培養(yǎng)20 h。待臨用時，用滅菌水將菌苔洗下，作為實驗用菌懸液。

2.2 供試品溶液和標準品溶液的制備 精密稱取標準品和供試品（按照管碟法制備方法進行制備）適量，加滅菌水制成1 000 U/ml的溶液，再吸取5.0 ml 1 000 U/ml的溶液到100 ml量瓶中，定容至刻度得50 U/ml的溶液，備用。后續(xù)稀釋用pH7.8的磷酸鹽緩沖液稀釋到適宜的濃度?？蛇x擇劑間比為2∶1或4∶1，抗生素最終濃度范圍為0.1～0.85 U/ml，具體濃度可以根據(jù)培養(yǎng)結束后吸光度讀數(shù)在線性范圍內進行調整。如選擇高低濃度為0.5和0.25 U/ml的制備過程如下：精密量取50 U/ml的溶液10.0 ml置于100 ml量瓶中，定容至刻度得5 U/ml的溶液，分別精密量取5 U/ml的溶液5.0 ml置于50 ml和100 ml量瓶中，加入pH7.8的磷酸鹽緩沖液至刻度，搖勻，配制成濃度為高濃度為0.5 U/ml、低濃度為0.25 U/ml的溶液。

2.3 供試品溶液和標準品溶液的分裝 取經過高溫滅菌的石英比色皿16支，分別標記為1S1～1S4共4支，2S1～2S4共4支，1T1～1T4共4支，2T1～2T4共4支，然后按照拉丁方的排列順序分別排列好。精密吸取標準品溶液的高濃度溶液、低濃度溶液及供試品溶液的高濃度溶液、低濃度溶液各1.00 ml按標記的對應編號加入相應的比色皿中。加入標準品溶液和供試品溶液時，均在有標記處沿管壁緩緩加入。

2.4 含試驗菌液體培養(yǎng)基的制備 臨用前，取規(guī)定的試驗菌懸液適量（35～37℃培養(yǎng)2～4 h后測定的吸光度在0.3～0.7之間，且劑距為2的相鄰劑量間的吸光度差值不小于0.1），加入到各規(guī)定的液體培養(yǎng)基中，混合，使在試驗條件下能得到滿意的劑量-反應關系和適宜的測定濁度。

2.5 培養(yǎng)基的分裝 取含試驗菌的液體培養(yǎng)基，分裝至比色皿中，每管精密加入9 ml。加入培養(yǎng)基時，應在加入樣品溶液的標記處稍上方，然后沿著管壁緩緩流入，以便將沾在管壁上的供試品溶液和標準品溶液一起沖入比色皿底部，待溶液和培養(yǎng)基全部加完后，蓋上塞子，水平輕輕搖勻，使供試品溶液、標準品溶液和培養(yǎng)基混合均勻。

2.6 培養(yǎng) 使用WBS-100微生物比濁儀在37℃培養(yǎng)2～4 h。

2.7 測量與計算 使用WBS-100微生物比濁儀可進行恒溫振蕩培養(yǎng)并進行在線快速測量，測量后能進行自動計算并生成實驗報告。

3 結果

3.1 線性及其范圍試驗 精密稱取標準品（928 U/mg）適量，加滅菌水制成1 000 U/ml的溶液，用pH7.8的磷 酸 鹽 緩 沖 液 分 別 稀 釋 到0.10、0.15、0.20、0.265、0.37、0.51、0.72和1.00 U/ml的溶液，按濁度法操作。以濃度（C）的對數(shù)為橫坐標，以吸光度（A）為縱坐標，進行線性回歸。結果得到：Y=0.498 9X+0.043 6（r=0.997 5），說明在0.1～1 U/ml的濃度范圍內，抗生素濃度的對數(shù)與吸光度呈直線關系。

3.2 精密度試驗 取1 000 U/ml標準品溶液配制成濃度為0.25和0.5 U/ml的溶液，按照濁度法進行精密度試驗，共測定9次，濁度法的精密度可以達到方法學驗證的要求，RSD為0.6%。

3.3 回收率試驗 選擇90%、100%和110%三點進行回收率試驗。精密稱取標準品適量，加pH7.8的磷酸鹽緩沖液制成1 000 U/ml的溶液。分別精密量取該溶液4.5、5.0和5.5 ml至100 ml的量瓶中，用pH7.8的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，得到45、50和55 U/ml的溶液，分別精密量取10.0 ml置于100 ml量瓶中，加入pH7.8的磷酸鹽緩沖液至刻度，搖勻，配制成濃度為4.5、5.0和5.5 U/ml的溶液。精密量取4.5 U/ml的溶液5.0 ml分別置于100和50 ml量瓶中，加入pH7.8的磷酸鹽緩沖液至刻度，搖勻，制備成濃度為0.225和0.45 U/ml的溶液，作為試驗用90%標準品溶液；精密量取5.0 U/ml的溶液5.0 ml分別置于100和50 ml量瓶中，加入pH7.8的磷酸鹽緩沖液至刻度，搖勻，制備成濃度為0.25和0.5 U/ml的溶液，作為試驗用100%標準品溶液；精密量取5.5 U/ml的溶液5.0 ml分別置于100和50 ml量瓶中，加入pH7.8的磷酸鹽緩沖液至刻度，搖勻，制備成濃度為0.275和0.55 U/ml的溶液，作為試驗用110%標準品溶液。按照濁度法進行試驗，結果平均回收率為99.63%，RSD為0.3%。見表1。

表1 回收率試驗結果

3.4 多個廠家、多個紅霉素品種濁度法與管碟法測定結果的比較 本文選取了多個廠家的紅霉素相關品種：紅霉素腸溶片、依托紅霉素片、紅霉素腸溶膠囊、依托紅霉素顆粒、琥乙紅霉素片，分別采用兩種方法進行測定。琥乙紅霉素相關樣品通過室溫放置16 h或40℃放置6 h達到水解完全，依托紅霉素相關樣品通過60℃水浴中放置4 h達到水解完全，最后都是采用和紅霉素標準品進行比較得出結果。水解時間是影響含量測定效價值的關鍵因素，水解時間短，樣品水解不充分會導致最終結果偏低；水解時間過長，則會使水解得到的紅霉素再發(fā)生降解，導致效價測定值發(fā)生偏差。結果表明，濁度法測定結果精密度高。見表2。

表2 多個廠家紅霉素相關品種濁度法、管碟法測定結果比較

4 討論

管碟法和濁度法都是在適宜條件下，根據(jù)量反應平行線原理設計，通過檢測抗生素對微生物的抑制作用，計算抗生素活性（效價）的方法。管碟法是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內的擴散作用，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產生抑菌圈的大??；濁度法是利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對試驗菌生長的抑制作用，通過測定培養(yǎng)后細菌濁度值的大小，比較標準品與供試品對試驗菌生長抑制的程度［1］。

抗生素微生物檢定法自40年代建立以來仍作為經典方法之一收載于各國藥典，目前，管碟法、濁度法被作為抗生素微生物檢定方法，收載于《中國藥典》中。管碟法的缺點是專屬性差，凡具有抗菌活性的物質都會干擾檢驗結果，并且操作步驟多、復雜，影響試驗結果準確度的因素較多，需要從各個環(huán)節(jié)加以嚴格控制，減少結果誤差。

濁度法測定抗生素效價時抗生素溶液的濃度非常低，微生物污染對濁度法測定效價有很大影響，因此試驗器具采用單獨浸泡、單獨清洗的方式，可以減少試驗過程的交叉污染。濁度法對試驗用培養(yǎng)基的靈敏度的要求比較高，使用的培養(yǎng)基應澄明，顏色以盡量淺為佳，培養(yǎng)基經滅菌后、培養(yǎng)后本身不得出現(xiàn)沉淀。根據(jù)這一原則，通過對培養(yǎng)基的預試，挑選合適品牌的產品使用［2］。紅霉素濁度法測定用試驗菌為金黃色葡萄球菌，為保證試驗的成功率，此菌懸液建議臨用現(xiàn)制。經本試驗驗證，與微生物管碟法比較，濁度法具有快速（僅需3～4 h）、易于操作、可在線測定、采用液體培養(yǎng)法、無擴散因素影響、靈敏度高和精密度較好等優(yōu)點，適用于紅霉素及其相關品種的含量測定。

但是，抗生素效價測定對人員的專業(yè)技能和經驗水平有較高的要求，檢驗人員上崗前應接受相應的培訓，包括實驗室生物安全方面、微生物檢驗技術及效價測定相關檢測方法、程序、檢測目的、檢驗中的影響因素等的培訓，上崗后通過不斷提高檢驗技能，掌握檢驗技巧，才能確保檢驗結果的準確性。

總之，伴隨著高效液相色譜法等化學分析方法的發(fā)展和進一步應用，越來越多的抗生素微生物檢定分析方法逐步被化學分析方法所取代，但是，對于多組分抗生素，抗生素微生物檢定法仍然具有不可替代的優(yōu)勢。而且隨著抗生素的廣泛應用、新的抗菌藥物的研發(fā)和近年來抗生素耐藥性的產生，對于抗生素耐藥菌株的分析和研究，抗生素微生物檢定法也有著廣闊的發(fā)展前景。