劉曉強，汪嘉麗，張巖琛

（常州市食品藥品纖維質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，江蘇 213102）

奧美拉唑是苯咪唑的衍生物，屬于第一代H+/K+-ATP酶（質(zhì)子泵）抑制劑，能夠有效抑制胃酸的分泌，臨床上廣泛用于治療酸相關(guān)性疾?。?-3］。奧美拉唑易溶于堿而不溶于水，故臨床注射劑均使用其鈉鹽。目前制備靜脈給藥制劑時，一般使用不銹鋼容器和管道，某些藥物如奧美拉唑鈉在受熱時與金屬容器、管道、濾器等較長時間接觸后，會導(dǎo)致溶液顏色變深，添加適量的EDTA-2Na等金屬離子絡(luò)合劑，可防止主藥與金屬離子發(fā)生反應(yīng)，減少溶液變色［4-5］。

EDTA-2Na與鈣離子結(jié)合成可溶的絡(luò)合物引起鈣的減少，靜脈制劑中使用依地酸二鈉會導(dǎo)致血鈣下降［6-7］，因此，需密切關(guān)注和嚴(yán)格控制靜脈給藥制劑中依地酸二鈉的用量。同時，基于藥物一致性評價要求，建立適當(dāng)?shù)姆椒ù_定仿制藥與原研制劑中EDTA-2Na含量差異也十分必要。

1 儀器與試藥

1.1 儀器XS105DU電子天平（瑞士Mettler Toledo）；LC-20D高效液相色譜儀（含雙高壓泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、UV檢測器、色譜工作站，日本島津公司）。

1.2 試藥EDTA-2Na·2H2O（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20200701）；試驗用水（去離子純凈水，實驗室自制）；磷酸二氫銨（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20190318，含量≥99.5%）；硫酸銅（分析純，GENERAL-REAGENT，批號P1587678）；乙腈（色譜純，Merck Company，批號JA091830）；注射用奧美拉唑鈉［規(guī)格：40 mg/支；生產(chǎn)企業(yè)A，批號A1、A2、A3；生產(chǎn)企業(yè)B，批號B1、B2、B3；生產(chǎn)企業(yè)C，批號C1、C2、C3；生產(chǎn)企業(yè)D（原研廠家），批號D1、D2、D3；生產(chǎn)企業(yè)E，批號E1、E2、E3］。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Titank C18，250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相A：0.5 %磷酸二氫銨（用磷酸調(diào)pH至3.0），流動相B：乙腈，按表1進(jìn)行梯度洗脫。檢測波長為254 nm，柱溫為30℃，流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣量為20μl［8］。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取EDTA-2Na·2H2O對照品約100 mg，置100 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1 mg/ml的對照品儲備液。依次精密量對照品儲備液2、2、3、5、5和5 ml，分別置200、100、100、100、50和25 ml量瓶中，精密加入0.04 mol/L的硫酸銅溶液適量（定容體積的2%），加水溶解并定容至刻度，搖勻即得10、20、30、50、100和200μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品1支量，置50 ml量瓶中，精密加入0.04 mol/L的硫酸銅溶液1 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液。

2.3 專屬性試驗 取空白溶劑水、2% 0.04 mol/L的硫酸銅溶液、濃度為30μg/ml的對照品溶液和供試品溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，采集色譜圖。結(jié)果，空白溶劑水、2% 0.04 mol/L的硫酸銅溶液均未在待測成分EDTA-2Na·2H2O處出峰，不干擾檢測。見圖1。

圖1 空白溶劑（A）2% 0.04 mol/L的硫酸銅（B）對照品（C）供試品（D）HPLC色譜圖

2.4 線性試驗 按照線性標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備方法分3 d分別進(jìn)行溶液制備和HPLC分析，記錄色譜圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以對照品峰面積（A）對濃度（C）作權(quán)重回歸計算，結(jié)果分別為：A=10 080.35C+10 477.44（r=0.999 9）、A=11 289.69C+1 0437.27（r=0.999 9）、A=12 689.26C+10 434.81（r=0.999 9）。結(jié)果表明EDTA-2Na·2H2O在10～200μg/ml的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，均符合要求。

2.5 檢測限與定量限 定量限溶液：精密量取對照品儲備液5 ml，置50 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為100μg/ml的EDTA-2Na·2H2O溶液，精密量取3 ml，置100 ml量瓶中，精密加入0.04 mol/L的硫酸銅溶液2 ml，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（3μg/ml）。檢測限溶液：精密量取上述濃度為100 μg/ml的EDTA-2Na·2H2O溶液2 ml，置200 ml量瓶中，精密加入0.04 mol/L的硫酸銅溶液4 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，即得（1μg/ml）。分別按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測得定量限溶液EDTA-2Na·2H2O的信噪比為15.17；檢測限溶液EDTA-2Na·2H2O的信噪比為4.68，滿足檢測要求。

2.6 重復(fù)性試驗 分別取6份供試品溶液（批號為A1）各20μl，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果RSD為0.33%，表明重復(fù)性良好。

2.7 中間精密度試驗 連續(xù)3 d分別由3人制備樣品溶液各6份，依次用3臺不同品牌儀器取20μl進(jìn)樣，按照“2.1”項下色譜條件測定，并計算含量。3 d的RSD依次為0.33%、0.51%和0.54%，總RSD為0.44%，該檢測方法中間精密度良好。

2.8 準(zhǔn)確度（加樣回收率）試驗 取本品1支，加水溶解并轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中，依次分別精密加入對照品儲備液0.75、1.5和2.25 ml，精密加入0.04 mol/L的硫酸銅溶液1 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，即得，平行制備3份。依次取上述溶液各20μl進(jìn)樣，記錄色譜圖。計算公式：測得加入濃度=測得濃度-樣品濃度，加樣回收率=測得加入濃度/加入濃度×100%。結(jié)果EDTA-2Na·2H2O平均回收率為100.47%，RSD為0.78%，且平行性良好，該方法準(zhǔn)確度良好。見表2。

表2 EDTA-2Na·2H2O加樣回收率測定結(jié)果

2.9 耐用性試驗

2.9.1 柱溫耐用性 依次改變柱溫（35和45℃），取濃度為30μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液進(jìn)樣20μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，EDTA-2Na·2H2O與相鄰色譜峰之間的分離度以及進(jìn)樣精密度均符合要求。

2.9.2 流動相比例耐用性 依次改變初始流動相比例為A∶B（99∶1）及A∶B（98∶2），初始比例為A∶B（99∶1）時，EDTA-2Na·2H2O與相鄰色譜峰之間的分離度以及進(jìn)樣精密度均符合要求。初始比例為A∶B（98∶2）時，分離度已不符合要求。

2.9.3 流動相pH耐用性 依次改變A相pH值（2.5和3.5），取標(biāo)準(zhǔn)線性3溶液進(jìn)樣20μl，pH為2.5時，連續(xù)進(jìn)樣6次，EDTA-2Na·2H2O與相鄰色譜峰之間的分離度以及進(jìn)樣精密度均符合要求。pH為3.5時，EDTA-2Na·2H2O與相鄰色譜峰之間的分離度不符合要求。

2.9.4 流速耐用性 依次改變流速為0.8和1.2 ml/min，當(dāng)流速為0.8 ml/min時，分離度不符合要求，流速為1.2 ml/min時，EDTA-2Na·2H2O與相鄰色譜峰之間的分離度以及進(jìn)樣精密度均符合要求。

2.9.5 儀器及色譜柱耐用性 依次改變儀器品牌型號和色譜柱品牌型號（Waters 2695+XBridge C18，250 mm×4.6 mm，5μm；Agilent 1200+XTerra C18，250 mm×4.6 mm，5μm），取標(biāo)準(zhǔn)線性3溶液進(jìn)樣20μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，EDTA-2Na·2H2O與相鄰色譜峰之間的分離度以及進(jìn)樣精密度均符合要求。

2.10膜過濾試驗 取本品1支，加水溶解并轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中，精密加入0.04 mol/L的硫酸銅溶液1 ml，加水稀釋至刻度，搖勻即得。分別取初濾液、棄去1、2、3、4、5、6、7、8和9 ml濾液進(jìn)樣。結(jié)果表明，EDTA-2Na·2H2O無明顯膜吸附現(xiàn)象。

2.11 樣品測定 分別取前述5個廠家15個批次的注射用奧美拉唑鈉適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依次取20μl進(jìn)樣，按外標(biāo)法計算含量。結(jié)果市售各廠家（A、B、C、E）與原研廠家（D）EDTA-2Na·2H2O含量均在1.4 mg/支左右。見表3。

表3 5個廠家注射用奧美拉唑鈉中EDTA-2Na·2H2O含量差異比較

3 討論

EDTA-2Na在C18色譜柱上保留較弱，出峰時間與死時間相近，色譜峰存在明顯的前沿峰，同時，在分析過程中部分Na離子會解離出來，色譜峰峰型較差，同時EDTA-2Na在紫外光譜區(qū)響應(yīng)較弱，無特征吸收峰，無法直接測定EDTA-2Na。EDTA-Cu較EDTA-2Na更穩(wěn)定，色譜保留更強，且有明顯的紫外特征吸收（254 nm）。因此選擇柱前衍生化法將EDTA-2Na轉(zhuǎn)換成EDTA-Cu，以獲得更好的峰型及色譜分離。本試驗中，對照品溶液澄清無色，樣品溶液較渾濁，需過濾后進(jìn)樣。查閱相關(guān)文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)奧美拉唑鈉在pH<7時不穩(wěn)定，易降解產(chǎn)生渾濁［9-11］。經(jīng)測定，2% 0.04 mol/L的硫酸銅溶液pH值約為4左右。在方法學(xué)驗證時，雖已驗證過EDTA-2Na·2H2O對照品溶液48 h內(nèi)穩(wěn)定，但由于樣品溶液渾濁，且樣品溶液中硫酸銅色譜峰消失，因此并未將穩(wěn)定性考查內(nèi)容置于正文中。同時也建議在樣品測定時，樣品臨用新配，確保數(shù)據(jù)的真實性和穩(wěn)定性。

本試驗同時選用了實驗室自制純化水和屈臣氏去離子水溶解上述15個批次的所有樣品，結(jié)果采用屈臣氏去離子水和實驗室自制純化水所制得的樣品從外觀上看，無論是顏色還是渾濁程度均無明顯差異；從測定結(jié)果看，采用屈臣氏去離子水和實驗室自制純化水所制得的樣品含量無明顯差異。從上述結(jié)果可以推斷，實驗室自制純化水中所含的各類離子等物質(zhì)均不影響EDTA-2Na·2H2O含量測定。

本次試驗共測定5個廠家15個批次的樣品，其中原研廠家3個批次，仿制廠家12個批次。上述15個批次EDTA-2Na·2H2O含量均為1.4 mg/支左右。其中，A、D和E三個廠家批次間差異更小，生產(chǎn)工藝更穩(wěn)定。

本方法在建立及驗證的過程中均采用的雜化硅膠柱，未嘗試其他類型C18柱，故建議在測定時也采用同類型色譜柱，同時建議采用25 cm柱長的色譜柱，避免EDTA-2Na·2H2O與相鄰雜質(zhì)分離度不符合要求。同時該方法流速、流動相比例、流動相pH值均不宜調(diào)整，若奧美拉唑鈉在所采用的C18柱上出峰較晚，可以適當(dāng)增加流速，或增加高有機相比例持續(xù)時間。