趙一宇，吳 瑩，趙 影，賴 畢，李勤凡

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 生物毒素實驗室，陜西 楊凌 712100)

瘋草(locoweed)是棘豆屬(Oxytropis)和黃芪屬(Astragalas)有毒植物，因含毒性成分為苦馬豆素(swainsonine,SW)，動物采食后不僅引起中毒死亡，還影響其繁殖和畜種改良[1-4]。在動物機體內(nèi)，由于SW陽離子與甘露糖陽離子空間結(jié)構(gòu)的相似性，SW對溶酶體α-甘露糖苷酶(lysosomal α-mannosidase，LAM)具有高度親和性，從而成為LAM的強烈抑制劑。瘋草中毒山羊血清LAM活性明顯下降，在SW含量大于5×10-6mol/L時，LAM的活性幾乎被全部抑制[5-6]，最終造成家畜體內(nèi)低聚糖代謝和糖蛋白合成受阻。目前，動物瘋草中毒的研究已有40多年，重點集中于對SW的毒性及脫毒方法研究，研制出的瘋草靈緩釋解毒丸[7]、預(yù)防瘋草中毒的中藥復(fù)方劑[8-9]和速康解毒口服液[10]等雖然取得了一定的療效，但大規(guī)模生產(chǎn)和推廣均受到了一定程度的限制，開展瘋草敏感動物L(fēng)AM結(jié)構(gòu)與酶活性的研究，有利于拓展瘋草中毒病的防治研究思路。

1 材料與方法

1.1 菌株及載體酵母表達(dá)菌株巴斯德畢赤酵母GS115、酵母表達(dá)載體pPIC9K和DH5α均由西北農(nóng)林科技大學(xué)預(yù)防實驗室提供；pMD19-T克隆載體購自大連寶生物公司。

1.2 主要試劑SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、LATaq酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶均購自大連寶生物公司；DNA膠回收試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；Ni-NTA resin及柱子、His標(biāo)簽鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(H+L)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DAB法顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；p-硝基-苯基-α-D甘露糖苷購自Sigma公司；野生型chLAM蛋白由本實驗室前期表達(dá)并保存。

1.3 引物設(shè)計根據(jù)GenBank中山羊α-甘露糖苷酶基因序列(JN602369.1)，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計4對特異性引物對含有保守活性位點的亞基片段A、C、D、T分別進(jìn)行擴(kuò)增。5′端均添加ATG，3′端均添加TAG和6×His Tag標(biāo)簽，兩側(cè)分別添加SnaBⅠ/NotⅠ酶切位點，引物序列見表1。

表1 引物信息

1.4 截短基因的獲得及克隆載體的構(gòu)建

1.4.1PCR擴(kuò)增 取7月齡莎能奶山羊肝臟，用TRIzol試劑提取肝臟細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板分別擴(kuò)增ChA、ChC、ChD和ChT基因片段。PCR反應(yīng)體系為25 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，Super MixⅡ酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退30 s，72℃延伸1～2 kb/min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.4.2重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將擴(kuò)增片段進(jìn)行膠回收后與pMD19-T載體連接,經(jīng)藍(lán)白斑篩選，獲得pMD19T-ChA、pMD19T-ChC、pMD19T-ChD和pMD19T-ChT重組陽性質(zhì)粒,同時進(jìn)行菌液PCR，將陽性質(zhì)粒送公司測序。

1.5 重組酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定將4種重組陽性質(zhì)粒和載體pPIC9K分別用SnaBⅠ和NotⅠ雙酶切，分別回收酶切后目的片段與線性化后的pPIC9K，加入T4DNA連接酶于16℃連接過夜，構(gòu)建重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-ChA、pPIC9K-ChC、pPIC9K-ChD和pPIC9K-ChT。并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板進(jìn)行篩選培養(yǎng)。提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，使用載體pPIC9K通用引物ADX篩選陽性菌落。

1.6 重組酵母菌的轉(zhuǎn)化和鑒定參照文獻(xiàn)[8]將線性化的4種重組酵母表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至GS115感受態(tài)細(xì)胞。電轉(zhuǎn)條件：電容25 μF，電壓1.5 kV，電阻200 Ω。篩選G418抗性菌株作為陽性轉(zhuǎn)化子，菌落PCR鑒定重組菌。

1.7 重組酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá)和酶活性檢測參照文獻(xiàn)[11]對重組酵母菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)120 h后分別收集上清和菌體沉淀。收集的酵母沉淀分別進(jìn)行超聲破碎，對重組酵母菌上清和菌體沉淀超聲破碎后的上清進(jìn)行α-甘露糖苷酶活性測定。

1.8 截短蛋白ChLAMt的純化采用Ni柱純化法,按Ni-NTA His·Bind resin說明書進(jìn)行。經(jīng)10%SDS-PAGE分析純化的ChLAMt蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，置于5%脫脂奶粉中封閉過夜。以His標(biāo)簽鼠單克隆抗體為一抗，4℃過夜孵育；TBST洗3次，以HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(H+L)作為二抗，室溫振蕩孵育2 h，TBST洗膜3次，加入DAB顯色。

1.9 pH、溫度和金屬離子對ChLAMt活性的影響在pH4.5、不同溫度(25～75℃)條件下測定酶的最適溫度；在50℃、不同pH(3.0～8.0)條件下測定酶的最適pH；測定Zn2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Ca2+、Fe3+、Mn2+、Co2+、Al3+、EDTA離子對ChLAMt活性的影響；在50℃、pH5.5條件下設(shè)定不同的底物濃度與樣品反應(yīng)，建立回歸曲線計算ChLAMt米氏常數(shù)(Km)；試驗重復(fù)3次并求其平均值。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計試驗數(shù)據(jù)用SPSS 24.0 軟件t檢驗分析差異顯著性。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 截短片段克隆的鑒定PCR法獲得ChA(878 bp)、ChC(480 bp)、ChD(730 bp)和ChT(2730 bp)4個截短基因片段，其大小與預(yù)期片段理論值相符(圖1)。

M.DL5000 DNA Marker；1.ChA片段擴(kuò)增產(chǎn)物；2.ChC片段擴(kuò)增產(chǎn)物；3.ChD片段擴(kuò)增產(chǎn)物；4.ChT片段擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定對提取的構(gòu)建成功的重組酵母質(zhì)粒pPIC9K-ChA、pPIC9K-ChC、pPI-C9K-ChD和pPIC9K-ChT使用載體通用引物進(jìn)行測序，結(jié)果讀碼框正確。

2.3 重組酵母菌株基因組PCR 擴(kuò)增結(jié)果擴(kuò)增結(jié)果顯示，pPIC9K空質(zhì)粒及pPIC9K-重組質(zhì)粒均已成功轉(zhuǎn)化到酵母表達(dá)菌株GS115中，重組質(zhì)粒和重組菌基因組的PCR結(jié)果中可見特異性條帶，與目的基因擴(kuò)增結(jié)果相符(圖2)。

M.DL5000 DNA Marker；1.ChT片段擴(kuò)增；2.pPIC9K-ChLAMt重組質(zhì)粒擴(kuò)增；3.pPIC9K-ChLAMt重組菌基因組擴(kuò)增；4.空白pPIC9K重組菌基因組擴(kuò)增

2.4 表達(dá)產(chǎn)物酶活性檢測pPIC9K-ChT重組酵母菌表達(dá)上清D405 nm值為0.298 5，菌體沉淀超聲破碎后D405 nm值為0.298 5，求得陽性重組酵母菌株GS115/pPIC9K-ChT誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物中ChLAMt活性為35 U。而pPIC9K-ChA、pPIC9K-ChC、pPIC-9K-ChD陽性重組菌株表達(dá)上清的D405 nm值均為0.000 0，3個重組菌株菌體超聲破碎后D405 nm值均為0.000 0，這3個小片段所構(gòu)建的陽性酵母菌株對其特異底物均無酶活性。

2.5ChLAMt的SDS-PAGE和Western blot鑒定SDS-PAGE通過計算機成像分析，Western blot試驗檢測到PVDF膜在90 kDa左右處有目的條帶，即為檢測的ChLAMt蛋白條帶(圖3，4)。

M.蛋白Marker；1,2.均為已純化的ChLAMt蛋白

1,2.均為已純化的ChLAMt蛋白

2.6 表達(dá)產(chǎn)物ChLAMt的特性鑒定通過測定不同溫度、pH及存在各種金屬離子或者抑制物的情況下(圖5,6)Zn2+、Ca2+能使酶活性升高(圖7)。對表達(dá)產(chǎn)物ChLAMt進(jìn)行米氏常數(shù)的測定，分析表達(dá)產(chǎn)物ChLAMt對不同濃度梯度的特異性底物的作用結(jié)果，利用雙倒數(shù)作圖法作圖，計算表達(dá)產(chǎn)物ChLAMt的米氏常數(shù)(Km)=0.93。

圖5 溫度對截短型ChLAMt和野生型ChLAM蛋白活性的影響

圖6 pH對截短型ChLAMt和野生型ChLAM蛋白活性的影響

圖7 金屬離子和抑制物對截短型ChLAMt蛋白和野生型ChLAM蛋白活性的影響

3 討論

家畜瘋草中毒對草原畜牧業(yè)危害嚴(yán)重，學(xué)術(shù)界一直致力于家畜瘋草中毒的防治研究，并取得了一定的進(jìn)展，但至今沒有易于推廣的防治方法。棘防A、C和D號理論上能破壞SW的結(jié)構(gòu)，棘防B、E號提高動物體內(nèi)LAM的活性[12]，但尚未見解毒機制方面的研究報道。在使用效果方面，給綿羊服用棘防A號，雖然能推遲中毒癥狀出現(xiàn)的時間，但還不能完全預(yù)防瘋草對綿羊內(nèi)臟器官的損害作用[13]。王保海等[9]研制的預(yù)防瘋草中毒的中藥復(fù)方劑，主要由陳皮、升麻等中藥和微量元素混合劑組成，其解毒原理是提高機體免疫力、促進(jìn)代謝，但并非針對瘋草中毒的特異性解毒劑。郝寶成[10]研制的速康解毒口服液由酵母甘露聚糖、正磷酸鈉、L-鼠李糖等原料按一定比例組成，理論上推測可誘導(dǎo)LAM的合成，尚未進(jìn)行試驗驗證。同時，SW抑制LAM的能力極強，即使補充酶合成的原料能促進(jìn)酶的合成，多產(chǎn)生的酶也被SW抑制，難以從根本上解毒。家畜食用參考文獻(xiàn)[14]報道的瘋草解毒劑后一定時間內(nèi)采食瘋草不會引起中毒，解毒劑中的亞鐵鹽、鋅鹽、銅鹽的物質(zhì)量比理論上具有毒性，且預(yù)防時間短，一次給藥不能使動物度過荒草期。由于現(xiàn)有解毒劑的局限性，探索效果更優(yōu)的瘋草解毒劑勢在必行。

LAM屬于糖苷水解酶38家族(GH38)，具有外切甘露糖的活性，可催化天冬酰胺連接的α1,2-高甘露聚糖、α1,3-高甘露聚糖、α1,6-高甘露聚糖的水解。在動物細(xì)胞內(nèi)，LAM缺陷或酶活被SW抑制后，會引起N-聚糖代謝異常，出現(xiàn)溶酶體貯積癥和動物瘋草病。酶替代療法(enzyme replacement therapy，ERT)已被用于治療輕至中度溶酶體貯積癥[15]，因此開展ERT研究將是治療動物瘋草中毒的有益嘗試。目前,對瘋草敏感動物L(fēng)AM的研究十分有限，制約了ERT治療瘋草中毒的研究。僅有的研究表明，ChLAM蛋白基因編碼的蛋白相對分子質(zhì)量大，外源表達(dá)蛋白表達(dá)量少，活性低[16]。本試驗根據(jù)文獻(xiàn)[11]對ChLAM蛋白分子對接分析和蛋白空間晶體結(jié)構(gòu)等的預(yù)測結(jié)果，對ChLAM蛋白各結(jié)構(gòu)域進(jìn)行截短表達(dá)，以解析蛋白亞基結(jié)構(gòu)域與催化活性之間的關(guān)系，結(jié)果顯示ChA，ChC，ChD所編碼的蛋白均沒有LAM活性，ChT表達(dá)產(chǎn)物與野生型蛋白有相似的酶活、最適溫度及pH。截短型蛋白ChLAMt的熱穩(wěn)定性高于野生型蛋白，可能截去E亞基降低了二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則片段的含量，使螺旋含量增加引起的；同時，野生型蛋白具有更強的耐酸性；Zn2+、Ca2+對ChLAMt活性均有促進(jìn)作用，與文獻(xiàn)報道ChLAM的性質(zhì)一致[16]。ChT比野生型LAM蛋白缺少E亞基，包含A、C、D 3個亞基中高度保守的催化活性位點，單獨的A、C、D 3個亞基雖含有催化活性位點，但不能產(chǎn)生LAM活性，意味著3個亞基高度保守的活性位點共同參與酶催化反應(yīng)。本試驗研究LAM截短體酶學(xué)性質(zhì)，就是要為進(jìn)一步開展瘋草中毒病ERT治療研究提供資料。