王捷頻，張雨婷，肖 東

(1.汕頭大學醫(yī)學院，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，廣東 汕頭 515041；3.深圳市兒童醫(yī)院，廣東 深圳 518000)

神經(jīng)母細胞瘤作為最常見的兒童惡性腫瘤之一，發(fā)病機制尚不明確。其5年生存率在37%～69%之間[1]?；颊咴缙谕ǔＪ菬o癥狀，少數(shù)因腫瘤的數(shù)量及位置伴有腹痛、腹脹及便秘[2]。由于缺乏特異性的早期癥狀與腫瘤標志物，50%的高風險患者在診斷時已伴有腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移[3]。因此，識別神經(jīng)母細胞瘤中參與腫瘤轉(zhuǎn)移的預后標志物，對于早期診斷及阻斷轉(zhuǎn)移過程具有重要意義。本研究通過生物信息學分析識別神經(jīng)母細胞瘤遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)的網(wǎng)絡樞紐基因并分析其參與的調(diào)控過程，以期為神經(jīng)母細胞瘤的診斷及治療提供新的策略。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)下載和預處理

在GEO數(shù) 據(jù)庫 （http://www.ncbi.nlm.gov/geo）中檢索種屬為人并且與神經(jīng)母細胞瘤相關(guān)的測序數(shù)據(jù)集，并下載GSE90689數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集基于GPL6480平臺，包含神經(jīng)母細胞瘤原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶和正常骨髓細胞共57例樣本。根據(jù)研究目的，我們選擇了14例來自神經(jīng)母細胞瘤原發(fā)病灶的神經(jīng)節(jié)苷脂2細胞與10例來自轉(zhuǎn)移灶的神經(jīng)節(jié)苷脂2細胞的mRNA數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)進行ID轉(zhuǎn)換及標準化處理，以進行下一步研究。

1.2 篩選差異表達基因

篩選神經(jīng)母細胞瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的差異表達基因，利用R 3.460軟件Limma程序包進行分析，通過樣本中各個基因的表達量的均值±2倍標準差計算出|log2FC|的閾值為0.723。根據(jù)P＜0.05與|log2FC|＞0.723條件對數(shù)據(jù)進行過濾，將標本間的差異表達基因?qū)С觥?/p>

1.3 功能與通路富集分析

為進一步解釋差異表達基因在神經(jīng)母細胞瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的作用，利用DAVID數(shù)據(jù)庫（http://david.ncifcrf.gov）對差異表達基因進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析和基因本體論（gene ontology，GO）富集分析，以此實現(xiàn)基因與生物學功能上的連接，P＜0.05的功能與通路有統(tǒng)計學意義。

1.4 蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡的構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選

采用STRING 11.0（https://string-db.org）數(shù)據(jù)庫預測蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡，進一步研究蛋白之間相關(guān)作用的關(guān)系。將STRING中導出的網(wǎng)絡圖數(shù)據(jù)導入Cytoscape進一步優(yōu)化和分析，安裝MCODE插件聚類基因富集模塊，繪制蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡。安裝Cytohubba插件，選取候選模塊中相關(guān)性高的基因，通過最大團中心性（maximal clique centrality，MCC）算法篩選出神經(jīng)母細胞瘤轉(zhuǎn)移過程的樞紐基因。作為Cytohubba插件中11種算法之一，MCC已被證實在蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡中對關(guān)鍵蛋白的預測具有更好的效能[4]。

1.5 樞紐基因的表達水平與生存分析

利用R2平臺分析樞紐基因在腫瘤不同分期的表達水平與患者的生存時間。R2平臺（http://r2.amc.nl）是由荷蘭阿姆斯特丹學術(shù)醫(yī)學中心腫瘤基因組學系開發(fā)的基于網(wǎng)絡的基因組學分析和可視化平臺?；?0個樞紐基因高低表達組中患者的生存時間，我們在平臺中進行了Kaplan-Meier生存分析。

1.6 共表達網(wǎng)絡的構(gòu)建

為驗證樞紐基因是否具有相同的表達模式，即是否存在共調(diào)控、功能相關(guān)或處于同一通路，使用R軟件的加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡篩選包，構(gòu)建差異表達基因共表達網(wǎng)絡?；诟骰虻腜earson相關(guān)矩陣分析結(jié)果，確立β值并建立無尺度網(wǎng)絡，并通過層次聚類，將網(wǎng)絡中相關(guān)性較高的基因分成不同模塊。計算每個模塊的特征向量值，并合并了距離近的模塊。最后計算模塊基因與腫瘤分期及是否轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性，篩選出重要的模塊及其中的基因，以此驗證樞紐基因是否屬于同一通路，共同調(diào)控神經(jīng)母細胞瘤的遠處轉(zhuǎn)移。

1.7 驗證差異基因

在GEO數(shù)據(jù)庫中檢索并下載GSE90121數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集基于GPL570平臺，包含神經(jīng)母細胞瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶共16例樣本。對比10個樞紐基因在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的表達量，驗證其在神經(jīng)母細胞瘤轉(zhuǎn)移過程中的作用。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達基因

以P＜0.05與|log2FC|＞0.723篩 選 差 異 表 達 基因，共得到320個差異表達基因，其中包括上調(diào)基因162個，下調(diào)基因158個（圖1與圖2）。

圖1 差異表達基因的表達熱圖

圖2 差異表達基因的韋恩圖

2.2 差異表達基因的KEGG和GO富集分析

根據(jù)DAVID數(shù)據(jù)庫對原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間差異表達基因進行生物學功能和通路的富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示，差異表達基因生物學功能明顯富集在I型干擾素信號通路、對病毒的反應、免疫反應、細胞黏附、細胞分裂、血小板活化與血小板脫粒。細胞成分主要富集在細胞質(zhì)、細胞表面與染色質(zhì)。分子功能主要富集在蛋白結(jié)合。KEGG通路分析顯示，上調(diào)基因主要富集在礦物質(zhì)的吸收，而下調(diào)基因主要富集在造血系統(tǒng)與血小板的活化（圖3、圖4與圖5）。

圖3 上調(diào)差異表達基因的GO富集分析

圖4 下調(diào)差異表達基因的GO富集分析

圖5 KEGG富集分析

2.3 蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡構(gòu)建與樞紐基因篩選

利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡，將其導入Cytoscape進一步分析，并通過Cytohubba插件中的MCC算法得到網(wǎng)絡中的樞紐基因，包括IFI44L、IFI44、HERC5、HERC6、USP18、DDX60、ISG15、MX1、RSAD2、MX2（圖6）。

圖6 蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡

2.4 樞紐基因的生存預后與表達分析

通過R2平臺獲得10個樞紐基因在神經(jīng)母細胞瘤患者中的預后分析。其中，在IFI44L、HERC5、USP18、MX1、MX2高表達患者中，總體生存率更高。MX2是唯一一個在不同分期中表達水平差異有統(tǒng)計學意義的樞紐基因（P=0.02）（圖7）。

圖7 生存分析與不同分期的表達水平

2.5 共表達網(wǎng)絡的構(gòu)建

將320個差異表達基因納入共表達網(wǎng)絡分析，定義網(wǎng)絡拓撲擬合指數(shù)為0.8，得到最佳軟閾值β=8時的鄰接矩陣?；虬凑障嚓P(guān)性被分成10個模塊，經(jīng)模塊間相關(guān)性分析合并后得到9個模塊，其中與臨床性狀（是否轉(zhuǎn)移）和腫瘤分期相關(guān)性最高的為灰色模塊，且蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡中10個樞紐基因皆從屬于灰色模塊（圖8）。

圖8 加權(quán)共表達網(wǎng)絡分析

2.6 樞紐基因篩選后驗證

通過數(shù)據(jù)集GSE90121不同樣本差異表達分析，結(jié)果顯示10個樞紐基因在神經(jīng)母細胞瘤轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶中表達量存在差異。在轉(zhuǎn)移灶中以IFI44L、IFI44的高表達及MX2、MX1、USP18、ISG15、RSAD2、HERC5、DDX60的低表達為主（圖9）。

圖9 外部數(shù)據(jù)集中樞紐基因的表達熱圖

3 討論

神經(jīng)母細胞瘤作為兒童最常見的惡性腫瘤之一，其遠處轉(zhuǎn)移是患兒死亡的重要危險因素，然而其轉(zhuǎn)移機制目前尚不明確。本研究通過一系列生物信息學分析，篩選神經(jīng)母細胞瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間的差異表達基因，并通過蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡與共表達網(wǎng)絡對基因進行進一步篩選，確定了10個與神經(jīng)母細胞瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的樞紐基因?；谘芯康慕Y(jié)果，我們旨在尋找潛在的治療靶點，以減少患者早期轉(zhuǎn)移的可能。

我們研究中共篩選出320個差異表達基因，其中包括上調(diào)基因162個與下調(diào)基因158個。進行GO、KEGG富集分析，以探究差異表達基因之間的相互作用。上調(diào)基因主要富集在干擾素相關(guān)的信號通路與對病毒的反應。研究表明，干擾素通路的激活可以影響不同腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[5]。還有一種觀點認為Ⅰ型干擾素是由惡性細胞產(chǎn)生的，可以通過腫瘤細胞內(nèi)在或外在的方式引發(fā)免疫反應[6]。至于對病毒的反應，我們認為與通過Ⅰ型干擾素所引發(fā)的免疫反應有關(guān)。在Xin等[7]的研究表明CD200在神經(jīng)母細胞瘤中的過度表達，可下調(diào)機體的抗腫瘤免疫，調(diào)節(jié)腫瘤的免疫微環(huán)境。相比之下，下調(diào)基因主要富集于細胞黏附過程。細胞黏附過程在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，整合素作為主要的細胞黏附受體，決定了腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的定植位置[8]。此外下調(diào)的基因也富集于血小板的活化和脫粒。Stone等[9]證明P-選擇素介導的血小板結(jié)合促進了肺小細胞癌和神經(jīng)母細胞瘤的轉(zhuǎn)移。

研究中最終獲得10個與神經(jīng)母細胞瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的樞紐基因，分別是IFI44L、IFI44、HERC5、HERC6、USP18、DDX60、ISG15、RSAD2、MX1、MX2。通過分析樞紐基因的主要功能，我們發(fā)現(xiàn)Ⅰ型干擾素在其中扮演著關(guān)鍵角色[10]。為了研究10個樞紐基因在神經(jīng)母細胞瘤轉(zhuǎn)移中的作用，我們進行了加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡篩選分析并定位每個樞紐基因所在的模塊，10個樞紐基因皆屬于灰色模塊，說明樞紐基因可能通過I型干擾素信號通路在神經(jīng)母細胞瘤轉(zhuǎn)移的過程中共表達。Ⅰ型干擾素被認為是癌癥治療的雙刃劍[11]。據(jù)報道，干擾素特征基因在腫瘤的進展中起著不同的作用。Kim等[12]報道，干擾素誘導雙鏈RNA依賴蛋白激酶在黑色素瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中和結(jié)腸癌轉(zhuǎn)化中高度表達。Ⅰ型干擾素還可以上調(diào)免疫檢查點抑制劑的表達水平，抑制劑對程序性死亡受體1通路治療的阻斷具有抗性[13]。干擾素-α不僅可以增強程序性死亡受體1的表達，還可以在持續(xù)的免疫反應中對T細胞反應造成衰減[14]。然而，一些研究表明在神經(jīng)母細胞瘤中，Ⅰ型干擾素具有抗腫瘤作用。Streck等[15]在神經(jīng)母細胞瘤小鼠模型中測試了I型干擾素的抗血管生成活性。在干擾素-α治療的小鼠中，皮下和腹膜后的腫瘤明顯變小。他們還發(fā)現(xiàn)干擾素-α可以降低瘤內(nèi)成纖維細胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子的表達水平[16]。Dedoni等[17]報道干擾素-β可以通過調(diào)節(jié)P38 MAPK誘導人神經(jīng)母細胞瘤細胞的凋亡。這些研究表明，干擾素特征基因高表達的原因可能是神經(jīng)母細胞瘤進展中機體的自身免疫反應。我們認為干擾素特征基因可以作為神經(jīng)母細胞瘤患兒潛在的預后標志物與治療的分子靶點。

總而言之，我們通過一系列生物信息學研究識別了10個神經(jīng)母細胞瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的樞紐基因。這些基因與Ⅰ型干擾素信號通路關(guān)系密切，具有作為神經(jīng)母細胞瘤的診斷標志物及治療靶點的潛能。這些發(fā)現(xiàn)對揭示神經(jīng)母細胞瘤遠處轉(zhuǎn)移的研究進展具有重要意義。