趙凡 張建軍 蔡祥焜 邸松蕊 姜硯馨 呂美豫 田世民 王林元 鄭立新 王淳

高脂血癥是臨床上常見的一種慢性代謝性疾病,其發(fā)病隱匿,常誘發(fā)多種心腦血管疾病如動脈粥樣硬化、腦血管意外、高血壓、冠心病等疾病的發(fā)生。 長鏈非編碼 RNA (long non-coding RNAs,LncRNAs)是一類長度超過200 個核苷酸、編碼潛力有限的RNA,參與高脂血癥、動脈粥樣硬化、心肌肥厚、心肌纖維化等多種心血管疾病的調控[1]。 Lnc H19 是第一個被發(fā)現(xiàn)的LncRNA,具有多種生物學功能,參與調節(jié)細胞的增殖、分化和代謝。 研究發(fā)現(xiàn),H19 在肝臟中含量豐富,其表達受脂肪酸的刺激,可作為一種脂質感受器調節(jié)肝臟代謝動態(tài)平衡[2]。 微小RNA(MicroRNA,Mi RNAs)為一種約22個核苷酸的內源RNA,是脂類代謝的轉錄后調節(jié)因子[3]。 可結合并靶向mRNA,通過調節(jié)其衰退、失穩(wěn)或翻譯抑制,以調節(jié)靶蛋白的豐度[4-5]。 在斑塊的發(fā)生發(fā)展過程中,miRNA 可從斑塊的細胞成分中釋放到循環(huán)中,因此也常用作預測冠心病的生物標志物[6]。 生物學認為,LncRNAs 似乎是與 miRNA 通路相互作用的網(wǎng)絡存在,LncRNAs 既是miRNA 的來源,也是其抑制調節(jié)因子[7]。

中醫(yī)學認為,高脂血癥源在脾,標為痰、濕、瘀;發(fā)生多由于脾失健運,繼而導致痰、濕、瘀等病理產(chǎn)物,同時也是致病因素的產(chǎn)生。 課題組前期研究中發(fā)現(xiàn),健脾祛濕方可通過調節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)/肝 X 受體 α(liver X receptor α,LXRα)/三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(adenosine triphosphate binding cassette transporter A1,ABCA1)信號通路顯著改善脾虛濕盛型大鼠血脂異常情況。 目前有研究表明 PPARγ 是miR-130a/b 在前脂肪細胞、人肝細胞癌組織和肝細胞系中的靶標[8-9]。 故本實驗以高脂血癥大鼠為研究對象,探究健脾祛濕方調節(jié)血脂代謝的同時,選取Lnc H19、miR-130a-3p 為切入點,初步探討健脾祛濕方作用靶點上游是否存在非編碼RNA 的調控影響以介導肝臟的膽固醇逆轉運通路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級健康雄性 SD 大鼠,6 ~7 周齡,體質量(180±20)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號:SCXK(京)2016-0011]。 飼養(yǎng)于中國檢驗檢疫科學研究院SPF 級動物實驗室[許可證號:SYXK(京)2015-0039],實驗過程中大鼠自由飲水,飼養(yǎng)室溫度為20 ~26 ℃,相對濕度為40% ~70%,燈照周期為12 小時。 實驗符合相關倫理學要求(倫理審批號:2021-FD-019)。

1.2 實驗藥品

健脾祛濕方(紅曲 ∶白術 ∶葛根 ∶茯苓 ∶山楂比例為 3 ∶12 ∶16 ∶16 ∶12),其中紅曲購自武漢佳成生物制品有限公司,白術、葛根、茯苓、山楂購自北京晨益藥業(yè)有限公司;血脂康購自北京北大維信生物科技有限公司, 規(guī)格:0.3 g × 120 粒, 批號:20210340。

1.3 實驗試劑

總膽固醇(total cholesterol,TC,批號:211771)、甘油三酯(triglycerides,TG,批號:211101)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C,批號:211481)、低密度脂蛋白膽固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol,LDL-C,批號:211581)、血肌酐(serum creatinine,Scr,批號:210791)、血尿素(blood urea,BUN,批號:211101)檢測試劑盒均由中生北控生物科技有限公司提供。 總蛋白定量測試盒(BCA 法,批號:211771)由南京建成生物有限公司提供。 大鼠膽固醇酯轉運蛋白(cholesteryl ester transporter,CETP)Elisa 試劑盒(貨號:ml003189)、大鼠卵磷脂膽固醇?；D移酶(lecithin cholesterol acyltransferase,LCAT)Elisa 試劑盒(貨號:ml300981-2)均由上海酶聯(lián)生物有限公司提供。 RIPA 裂解液(貨號:P0013C)、PMSF(貨號:ST506)、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(貨號:P1045)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(貨號:A0208)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(貨號:A0216)購自碧云天生物科技有限公司。 PPARγ(貨號:16643-1-AP)、LXRα(貨號:14351-1-AP)、GAPDH(貨號:6004-1-1g)購自 proteintech 公司;ABCA1 抗體(貨號:ab66217)購自abcam 公司。

1.4 實驗儀器

ZS-MV 小動物麻醉機(中國北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司);TBA-120FR 型全自動生化分析儀(日本東芝);多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司);4-5R 離心機(中國湖南恒諾儀器設備有限公司);CFX 型熒光定量PCR 儀(美國Bio-Rad);濕轉印電泳槽、垂直電泳槽(美國Bio-Rad);凝膠成像系統(tǒng)(上海勤翔科學儀器有限公司)。

1.5 分組與造模

SD 大鼠適應性飼養(yǎng)7 天,造模前按體質量隨機分為2 組,空白組8 只,模型組40 只。 每周稱量體質量一次。 實驗第8 天,除空白組給予普通飼料喂養(yǎng)外,模型組(40 只)均采用高脂飼料喂養(yǎng)建立高脂血癥大鼠模型。 造模2 周后,空白組和模型組大鼠不禁食采血(眼內眥),采血后盡快分離血清,測定血清 TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平。

根據(jù)TC 水平將模型組隨機分成5 組:即功能模型組、血脂康組、健脾祛濕方低、中、高劑量組,分組后模型組各組間比較 TC、TG、LDL-C、HDL-C 差異均無顯著性。 分組后各組與空白組比較 TC、TG、LDL-C 差異有顯著性。 連續(xù)造模8 周。

1.6 給藥方法

正式分組后開始給藥,灌胃劑量為1 mL/100 g,除空白組、功能模型組給予生理鹽水外,血脂康組(0.12 g/kg,相當于成人每日0.02 g/kg)、健脾祛濕方低、中、高劑量組(1.2 g/kg、2.4 g/kg、3.6 g/kg 生藥量,相當于成人推薦量的5 倍、10 倍、15 倍)給予相應的藥物,連續(xù)給藥6 周。

1.7 觀察指標及檢測方法

1.7.1 一般觀察 觀察各組大鼠造模給藥后毛發(fā)、二便、精神活動狀態(tài)以及體質量的變化。

1.7.2 血脂四項 末次灌胃給藥7 小時后,大鼠不禁食眼眶采血。 采用全自動生物化學分析儀檢測血清 TC、TG、LDL-C、HDL-C 含量。 并根據(jù)公式(1)(2)計算 AI 及 R-CHR[10-11]。 (1)AI=(TC-HDL-C)/HDL-C;(2)R-CHR=TC/HDL-C。

1.7.3 血清中 AST、ALT、BUN、Scr 含量 取材前禁食不禁水12 小時,于取材前2 小時稱體質量后腹腔麻醉,腹主動脈取血,室溫靜置1 ~2 小時,3500 r/分鐘,離心15 分鐘,分離血清,取上清液。 采用全自動生物化學分析儀檢測 AST、ALT、Scr、BUN含量。

1.7.4 肝臟、主動脈脂質沉積的情況 油紅O 染色:肝臟、主動脈用OCT 包埋后,迅速放入液氮中,隨后使用冰凍切片機,將其切為厚度8 ~10 μm 的冰凍切片。 油紅O 染色10 分鐘,75%酒精分化2秒,水洗1 分鐘,蘇木素復染2 分鐘,自來水洗滌。1%鹽酸酒精分化并水洗,氨藍水洗后,甘油明膠封片,光學顯微鏡下觀察肝臟、主動脈脂質沉積情況。

1.7.5 血清中LCAT、CETP 含量 使用腹主動脈取血所得血清,按照ELISA 試劑盒說明書步驟,用酶聯(lián)免疫吸附法檢測LCAT、CETP 含量。

1.7.6 肝臟 PPARγ、LXRα、ABCA1 蛋白表達 采用RIPA 蛋白裂解液(按比例加入PMSF、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑),冰上勻漿,4 ℃,12000×g,離心10 分鐘,取上清,BCA 法進行組織濃度測定,計算上樣量,加入5×上樣緩沖液和定量RIPA 裂解液,制備成等濃度等體積的樣品,渦旋混勻,100 ℃變性5 分鐘。 配置SDS-PAGE 膠(8%分離膠+ 5%濃縮膠),上樣后先恒壓80 V 跑30 分鐘,隨后恒壓120 V 跑90 分鐘,至 marker 跑到底部停止電泳。 隨后進行轉膜,恒壓120V 90 分鐘,5%脫脂奶粉封閉1小時,1×TBST 洗滌 5 次,每次 5 分鐘,一抗 4 ℃孵育過夜,回收一抗。 1×TBST 洗滌 5 次,每次 5 分鐘,二抗室溫孵育1 小時,1×TBST 洗滌5 次,每次5 分鐘。制備顯影液,利用暗室顯影技術采集化學發(fā)光圖像、Image J 分析灰度值。

1.7.7 Real-time PCR 檢測肝臟 LncRNA H19、miR-130a-3p、PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA 表達 稱取大鼠肝臟,RNA 提取試劑盒提取大鼠肝臟RNA,去除DNA,使用反轉錄試劑盒合成cDNA,進行實時熒光PCR 檢測。 PCR 的反應條件:95 ℃ 10 分鐘,95 ℃ 15秒,60 ℃ 1 分鐘,40 個循環(huán),實驗重復 3 次。 采用2-ΔΔct相對定量法計算相對表達情況。 引物序列由武漢賽維爾生物科技有限公司合成,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示,多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析(One-way ANOVA),組間兩兩比較用LSD檢驗,以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計意義。

2 結果

2.1 大鼠的一般狀態(tài)

實驗期間,空白組大鼠精神狀態(tài)正常,活動自如,毛發(fā)正常。 功能模型組大鼠精神狀態(tài)一般,懶動嗜睡,毛發(fā)發(fā)黃易脫落。 各給藥組大鼠較模型組情況均有所改善。

2.2 健脾祛濕方對高脂血癥大鼠體質量的影響

給藥前,與空白組相比,功能模型組大鼠體質量顯著升高(P<0.01)。 與功能模型組相比,各給藥組大鼠體質量無顯著性差異。 給藥后,與空白組相比,功能模型組大鼠體質量顯著升高(P<0.01)。 與功能模型組相比,各給藥組大鼠體質量呈下降趨勢。 結果見表2。

表2 健脾祛濕方對高脂血癥大鼠體質量的影響(,n=8,g)

表2 健脾祛濕方對高脂血癥大鼠體質量的影響(,n=8,g)

注: 與空白組相比,aP<0.05,bP<0.01;與功能模型組相比,cP<0.05,dP<0.01。

組別 給藥前 給藥1 周 給藥2 周 給藥3 周 給藥4 周 給藥5 周 給藥6周±20.16功能模型組 396.65±16.69b 448.58±24.38b 493.07±27.12b 532.75±28.49b 554.20±38.69b 567.90±31.20b 582.00±39.21b血脂康組 376.47±14.61 407.46±11.61d 428.46±25.08d 459.81±25.30d 487.16±25.58d 496.88±27.01d 505.37±30.98d健脾祛濕方低劑量組 383.64±28.06 403.73±24.92d 437.13±27.18d 474.98±32.48d 511.32±42.37d 520.79±42.17d 530.95±42.21d健脾祛濕方中劑量組 385.43±16.88 414.71±25.17d 457.76±17.49c 493.76±21.76d 518.25±18.07c 542.04±28.88 552.83±29.39健脾祛濕方高劑量組 377.82±22.57 404.58±29.51d 431.16±32.16d 461.14±29.65d 483.52±27.67d 504.57±31.27d 516.47±32.56空白組 347.15±21.35 383.08±18.79 390.68±24.65 400.42±15.36 445.34±11.80 457.05±17.13 462.03 d

2.3 健脾祛濕方對高脂血癥大鼠血脂四項TC、TG、HDL-C、LDL-C、AI 及 R-CHR 的影響

2.3.1 給藥4 周后健脾祛濕方對高脂血癥大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C 的影響 與空白組相比,功能模型組大鼠 TC、 TG、 LDL-C 含量顯著升高(P<0.01),HDL-C 含量未見顯著性差異。 與功能模型組相比,血脂康、健脾祛濕方低、高劑量組大鼠TC 含量顯著降低(P<0.05),各給藥組大鼠TG 含量均顯著降低(P<0.01,P<0.05,P<0.05,P<0.05),LDL-C、HDL-C 含量有所降低,但未見顯著性差異。結果見表3。

表3 給藥4 周后健脾祛濕方對高脂血癥大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C 的影響(,n=8)

表3 給藥4 周后健脾祛濕方對高脂血癥大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C 的影響(,n=8)

注: 與空白組相比,aP<0.05,bP<0.01;與功能模型組相比,cP<0.05,dP<0.01。

組別 TC(mmol/L) TG(mmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-C(mmol/L)1.14±0.25 0.65±0.09 2.00±0.30 1.56±0.44 0.43±0.12 0.68±0.06功能模型組 2.75±0.40b 2.68±0.67b 1.19±0.24b 0.67±0.17血脂康組 2.37±0.33c 1.74±0.42d 1.11±0.19 0.59±0.08健脾祛濕方低劑量組 2.31±0.46c 1.95±0.89c 1.03±0.20 0.66±0.10健脾祛濕方中劑量組 2.64±0.31 2.01±0.58c 1.13±0.16 0.66±0.10健脾祛濕方高劑量組 2.30±0.22c 2.06±0.53c空白組

2.3.2 給藥6 周后健脾祛濕方對高脂血癥大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C 的影響 與空白組相比,功能模型組大鼠 TC、 TG、 LDL-C 含量顯著升高(P<0.01),HDL-C 含量顯著降低(P<0.01)。 與功能模型組相比,血脂康、健脾祛濕方中、高劑量組大鼠TC 含量顯著降低(P<0.01),各給藥組大鼠TG含量均顯著性降低(P<0.01),LDL-C 含量未見顯著差異,健脾祛濕方中、高劑量組大鼠HDL-C 含量有所升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結果見表4。

表4 給藥6 周后健脾祛濕方對高脂血癥大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C 的影響(,n=8)

表4 給藥6 周后健脾祛濕方對高脂血癥大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C 的影響(,n=8)

注: 與空白組相比,aP<0.05,bP<0.01;與功能模型組相比,cP<0.05,dP<0.01。

組別 TC(mmol/L) TG(mmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-C(mmol/L)1.80±0.30 1.41±0.29 0.40±0.07 0.90±0.06功能模型組 3.20±0.54b 2.72±0.47b 1.36±0.22b 0.75±0.06b血脂康組 2.57±0.29d 1.52±0.41d 1.20±0.22 0.70±0.12健脾祛濕方低劑量組 2.84±0.37 2.10±0.52d 1.20±0.16 0.87±0.13健脾祛濕方中劑量組 2.71±0.39d 2.03±0.38d 1.20±0.22 0.89±0.14c健脾祛濕方高劑量組 2.55±0.21d 2.05±0.46d 1.19±0.13 0.86±0.09空白組c

2.3.3 給藥4、6 周后健脾祛濕方對高脂血癥大鼠AI、R-CHR 的影響 給藥4 周時,與空白組相比,功能模型組大鼠AI、R-CHR 水平顯著升高(P<0.01);健脾祛濕方低劑量組 AI、R-CHR 水平顯著降低(P<0.01);給藥6 周后,血脂康、健脾祛濕方低、中、高劑量組AI、R-CHR 水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.01)。 結果見表5。

表5 給藥4、6 周,健脾祛濕方對高脂血癥大鼠AI、R-CHR 的影響(,n=8)

表5 給藥4、6 周,健脾祛濕方對高脂血癥大鼠AI、R-CHR 的影響(,n=8)

注:與空白組相比,aP<0.05,bP<0.01;與功能模型組相比,cP<0.05,dP<0.01。

4周6 周組別1.89±0.38 2.85±0.37 1.27±0.26 2.25±0.26功能模型組 3.65±1.03b 4.65±1.03b 3.03±0.71b 4.03±0.71b血脂康組 3.04±0.88 4.04±0.88 2.48±0.43c 3.48±0.43c健脾祛濕方低劑量組 2.68±0.52d 3.68±0.52d 2.42±0.26c 3.42±0.26c健脾祛濕方中劑量組 3.25±0.68 4.25±0.68 2.17±0.55d 3.17±0.55d健脾祛濕方高劑量組 3.08±0.56 4.08±0.56 2.26±0.33d 3.26±0.34 AI R-CHR AI R-CHR空白組d

2.4 健脾祛濕方對高脂血癥大鼠肝功能(AST、ALT)、腎功能(Scr、BUN)的影響

與空白組相比,功能模型組大鼠血清AST、ALT活性升高,其中 AST 升高差異顯著(P<0.05)。 與功能模型組相比,各給藥組AST、ALT 活性呈下降趨勢,血脂康、健脾祛濕方低、中、高劑量組AST 差異顯著,有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05)。

與空白組相比,功能模型組大鼠Scr 水平顯著升高(P<0.01),BUN 水平顯著降低(P<0.05)。與功能模型組相比,各給藥組Scr 水平呈下降趨勢,血脂康、健脾祛濕方低劑量組 Scr 顯著降低(P<0.05);血脂康、健脾祛濕方中、高劑量組BUN水平有上升趨勢,但無統(tǒng)計學差異。 結果見表6。

表6 健脾祛濕方對高脂血癥大鼠AST、ALT、Scr、BUN 的影響(,n=8)

表6 健脾祛濕方對高脂血癥大鼠AST、ALT、Scr、BUN 的影響(,n=8)

注: 與空白組相比,aP<0.05,bP<0.01;與功能模型組相比,cP<0.05,dP<0.01。

組別 AST(mmol/L) ALT(mmol/L) Scr(μmol/L) BUN(mmol/L)45.73±7.62 66.20±4.79 5.09±0.79 43功能模型組 195.90±72.66a 50.33±12.10 67.49±4.52b 4.65±0.62a血脂康組 133.65±30.04d 41.99±6.13 63.16±3.57c 5.08±0.35健脾祛濕方低劑量組 126.61±32.58d 43.65±10.84 61.43±3.14c 4.57±0.54健脾祛濕方中劑量組 132.90±29.60d 44.20±9.93 65.23±4.22 4.67±0.53健脾祛濕方高劑量組 146.54±28.67c空白組 145.70±21.24 42.31±2.98 60.39±3.12 5.36±0.

2.5 健脾祛濕方對高脂血癥大鼠肝臟、主動脈脂質沉積的影響

肝臟油紅O 染色:空白組大鼠肝臟切片中細胞界限清楚,未見細胞腫脹及染紅的脂肪沉積。 功能模型組大鼠肝細胞界限模糊,發(fā)生明顯的脂肪變性,內有大量脂肪空泡及紅色脂滴。 各給藥組肝細胞界限較模型組有所改善,脂滴含量明顯減少。 見圖1。

主動脈油紅O 染色:空白組大鼠胸主動脈壁上未見紅色脂滴。 功能模型組大鼠主動脈壁內呈大量紅染,可見明顯紅色脂滴。 各給藥組主動脈壁內紅染較功能模型組有所改善,脂滴含量明顯減少。見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟、主動脈脂質沉積情況

2.6 健脾祛濕方對高脂血癥大鼠血清CETP、LCAT含量的影響

與空白組相比,功能模型組大鼠血清CETP 含量顯著升高,LCAT 含量顯著降低(P<0.01)。 與功能模型組相比,血脂康、健脾祛濕方低、中、高劑量組大鼠血清CETP 含量顯著降低(P<0.01),LCAT含量顯著升高(P<0.01)。 結果見表7。

表7 健脾祛濕方對高脂血癥大鼠血清CETP、LCAT 含量比較(,n=8)

表7 健脾祛濕方對高脂血癥大鼠血清CETP、LCAT 含量比較(,n=8)

注: 與空白組相比, aP<0.05, bP<0.01;與功能模型組相比, cP<0.05,dP<0.01。

組別 CETP(ng/mL) LCAT(μmol/L)430.82±89.43 12.60±1.35功能模型組 686.37±79.12b 5.99±1.30b血脂康組 533.34±92.52d 9.44±1.16d健脾祛濕方低劑量組 536.10±52.31d 9.58±1.35d健脾祛濕方中劑量組 438.72±111.89d 9.48±0.59d健脾祛濕方高劑量組 325.93±85.07d 10.74±1.30空白組d

2.7 健脾祛濕方對高脂血癥大鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1 蛋白表達的影響

與空白組相比,功能模型組 PPARγ、LXRα、ABCA1 表達顯著降低(P<0.05)。 與功能模型組相比,各給藥組 PPARγ、LXRα、ABCA1 水平均呈上升趨勢,其中健脾祛濕方中、高劑量組PPARγ 含量顯著升高(P<0.05)。 結果見表8、圖2。

表8 健脾祛濕方對高脂血癥大鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1 蛋白表達的影響(,n=3)

表8 健脾祛濕方對高脂血癥大鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1 蛋白表達的影響(,n=3)

注: 與空白組相比,aP<0.05,bP<0.01;與功能模型組相比,cP<0.05,dP<0.01。

1.47±0.37 0.87±0.29組別 PPARγ/GAPDH LXRα 1.13±0.11 1.33±0.06 0.93±0.04功能模型組 0.81±0.16a 0.95±0.00a 0.79±0.07a血脂康組 0.94±0.07 1.07±0.17 0.95±0.30健脾祛濕方低劑量組 1.03±0.08 1.36±0.48 0.94±0.16健脾祛濕方中劑量組 1.18±0.12c 1.17±0.24 0.98±0.41健脾祛濕方高劑量組 1.20±0.33c/GAPDH ABCA1/GAPDH空白組

圖2 各組大鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1 蛋白表達的情況

2.8 健脾祛濕方對高脂血癥大鼠肝臟LncRNA H19、miR-130a-3p、PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA 表達的影響

與空白組相比,功能模型組LncRNA H19、miR-130a-3p 水平顯著升高(P<0.01,P<0.05)。 與功能模型組相比,各給藥組LncRNA H19 表達顯著降低(P<0.01);各給藥組miR-130a-3p 表達呈下降趨勢,血脂康、健脾祛濕方低、中劑量組差異顯著(P<0.05,P<0.01,P<0.05)。

與空白組相比,功能模型組 PPARγ、LXRα、ABCA1 表達降低,其中 LXRα、ABCA1 差異顯著(P<0.05)。 與功能模型組相比,各給藥組PPARγ、LXRα 水平呈上升趨勢,其中血脂康、健脾祛濕方中、高劑量組PPARγ 含量顯著升高(P<0.05);低劑量組LXRα 含量顯著升高(P<0.01)。 血脂康、健脾祛濕方低、中劑量組ABCA1 水平有所升高,但差異不具有統(tǒng)計學意義。 結果見表9。

表9 健脾祛濕方對高脂血癥大鼠肝臟LncRNA H19、miR-130a-3p、PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA 表達的影響(,n=3)

表9 健脾祛濕方對高脂血癥大鼠肝臟LncRNA H19、miR-130a-3p、PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA 表達的影響(,n=3)

注: 與空白組相比,aP<0.05,bP<0.01;與功能模型組相比,cP<0.05,dP<0.01。

0.83±0.15 0.93±0.25組別 LncRNA H19 miR-130a-3p PPARγ LXRα 3±0.48功能模型組 1.72±0.21b 1.14±0.15a 1.19±0.34 0.80±0.36a 1.02±0.32a血脂康組 0.89±0.18d 0.88±0.16c 2.18±0.08c 1.23±0.32 1.09±0.14健脾祛濕方低劑量組 0.71±0.04d 0.80±0.09d 1.53±0.77 2.07±0.80d 1.45±0.42健脾祛濕方中劑量組 0.87±0.07d 0.88±0.08c 2.26±0.50c 1.40±0.10 1.41±0.20健脾祛濕方高劑量組 1.06±0.09d 0.96±0.07 2.34±0.35c ABCA1空白組 0.79±0.19 0.87±0.11 1.33±0.40 1.67±0.15 1.7

3 討論

高脂血癥在我國具有低知曉率、低治療率、低控制率、高發(fā)病率的特點,其發(fā)病逐漸趨向年輕化。中醫(yī)認為高脂血癥為本虛標實之證,病位在脾肝腎,尤以脾失健運為主。 脾失運化,是引起高脂血癥的重要病機,因此常以健脾祛濕、化濁降脂作為基本治療原則。 課題組以“辨證保健”理論為指導,通過實驗驗證了健脾祛濕法對脾虛濕盛型高脂血癥大鼠的降血脂作用[12-14]。 本研究中的健脾祛濕方以紅曲、白術、茯苓、葛根、山楂五味中藥組成,具有健脾祛濕、化濁降脂的功效。 現(xiàn)代研究表明,紅曲中的洛伐他汀可競爭性地與HMG-CoA 還原酶結合,降低其活性,從而發(fā)揮抑制膽固醇合成的作用。王嵐等[15]發(fā)現(xiàn)紅曲對高脂血癥大鼠血脂具有一定的調節(jié)作用,可有效降低血清TC、TG,其中對TC 降低的效果更顯著。 寧素云等[16]認為山楂粉可有效改善高脂飲食ApoE-/-小鼠腸道菌群的構成,促進菌群的恢復,有效緩解高脂飲食所致的脂代謝紊亂的癥狀。 王均等[17]研究發(fā)現(xiàn)葛根的主要有效成分葛根素能顯著降低高脂癥大鼠TC、TG、LDL 的含量,升高HDL 含量,改善其全血全切變率及血漿黏度,達到顯著的降脂作用。 “脾臟補氣健脾第一藥”的白術,長于補氣復脾胃,利水除濕邪,研究發(fā)現(xiàn)白術精提取物在降低高脂血癥大鼠血清TC、TG、LDL-C、ACAT 水平,提高 LCAT 和 HDL-C 水平的同時,可降低肝臟中 HMG-CoA 還原酶、TC、TG 水平,對脂質代謝具有一定的調節(jié)作用[18]。

TC、TG、LDL-C 是冠心病和動脈粥樣硬化的危險因素[19],在脂質代謝的過程中,HDL-C 可以將TC、TG 從周圍組織輸送到肝臟,最后通過肝臟受體將其清除。 實驗結果顯示,健脾祛濕方可降低高脂血癥大鼠血清中TC、TG 水平,提高HDL-C 水平,表明健脾祛濕方可在一定程度上改善脂代謝紊亂。同時AI 和R-CHR 分別反映機體患動脈粥樣硬化和冠心病的風險。 實驗表明健脾祛濕方可降低高脂血癥大鼠血清中AI、R-CHR 水平,與其降血脂水平相對應,起到了預防動脈粥樣硬化、冠心病發(fā)生的作用。 當機體肝細胞受損時,AST、ALT 會被釋放到循環(huán)系統(tǒng)中,因此測定血清中AST、ALT 酶的活性可了解肝細胞的損傷程度[20-21]。 研究表明,功能模型組AST、ALT 活性升高,表明肝臟組織存在炎癥反應。 給藥6 周后,健脾祛濕方能使大鼠 AST、ALT 水平不同程度地降低,提示具有一定程度的肝臟保護作用。 血清中Scr、BUN 常用于評價腎功能,給藥后大鼠Scr、BUN 均有不同程度的改善,提示健脾祛濕方對腎功能無明顯影響。

CETP、LCAT 參與 HDL 重塑和代謝過程[22]。其中CETP 是一種參與脂蛋白之間膽固醇酯交換的酶,可促進 TC 從 HDL 向 LDL 或 VLDL 的轉移,最終導致 HDL 降低,LDL 和 VLDL 水平升高。 LCAT是一種富含糖類的糖蛋白,可催化血漿中最相關部分膽固醇酯的生物合成,TC 從外周組織到肝臟的運輸受到LCAT 的調控,LCAT 表達抑制,常引起 TC氧化增加、HDL 降低[23]。 實驗結果顯示,功能模型組大鼠CETP 表達增強,LCAT 受到抑制,健脾祛濕方干預后,低、中、高劑量組CETP 水平顯著性降低,LCAT 含量顯著升高,表明膽固醇酯從HDL 轉移到富含TG 的脂蛋白和LDL 的過程受到抑制。

Sun H、Huang Y 等[24-25]實驗研究發(fā)現(xiàn),LncRNA H19 的過表達可促進動脈粥樣硬化的進程、誘發(fā)缺血性中風,其基因敲除后可以緩解動脈粥樣硬化。PPARγ 信號通路作為膽固醇代謝的關鍵途徑,可通過誘導LXRα 的表達來增加ABCA1 的表達,以達到介導膽固醇代謝,減輕肝臟脂質沉積及炎癥反應的作用[26]。 Chu X 等[27]經(jīng)實驗證實了 PPARγ 是miR-130 的靶基因的同時,發(fā)現(xiàn)miR-130 下調可促進PPARγ 的表達,從而以抑制炎癥和心肌纖維化,起到保護心臟的作用。 研究結果顯示,各給藥組LncRNA H19、 miR-130a-3p mRNA 表 達 降 低,PPARγ、LXRα、ABCA1 蛋白及 mRNA 表達水平升高。

本實驗研究結果顯示,健脾祛濕方可降低高脂血癥大鼠 TC、TG、LDL-C、AI、R-CHR 水平,提高HDL-C 水平,減少肝臟、主動脈脂質沉積,一定程度上改善脂代謝紊亂,降低動脈粥樣硬化、冠心病的發(fā)病機率。 同時可提高 CETP 酶活性,降低 LCAT酶活性,抑制膽固醇酯從HDL 轉移到富含TG 的脂蛋白和LDL 的過程。 健脾祛濕方干預后高脂血癥大鼠肝臟LncRNA H19、miR-130a-3p mRNA 水平顯著降低,PPARγ、LXRα、ABCA1 蛋白及 mRNA 表達顯著增強。 提示健脾祛濕方可能通過調控LncRNA H19 正向靶向 miR-130a-3p 表達以介導 PPARγ/LXRα/ABCA1 信號通路的表達,以實現(xiàn)調節(jié)血脂代謝水平紊亂的作用。