屠騰， 劉艷麗， 王惠， 趙螢，2， 張旻

1. 軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 陜西省口腔疾病國際聯(lián)合研究中心 第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院急診與綜合臨床科，陜西 西安（710032）； 2. 西北大學(xué)附屬人民醫(yī)院，西安市人民醫(yī)院（西安市第四醫(yī)院），麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安（710100）

牙周組織是人體改建最為活躍的組織之一，這與牙周組織擔(dān)負(fù)咀嚼功能，承載咬合應(yīng)力有關(guān)。大量研究發(fā)現(xiàn)，牙周膜細(xì)胞的活性高低直接關(guān)系到牙周組織的適應(yīng)性改建能力以及牙周健康狀況。正常的咬合力刺激可促進(jìn)牙周膜自身的改建與再生能力維持，而咬合力缺失可導(dǎo)致牙周膜組織再生與改建能力減弱甚至喪失。牙周膜的改建和再生修復(fù)與力學(xué)刺激密切相關(guān)，但其機(jī)制目前尚未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)，牙周膜中存在牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cell，PDLSCs），具有多向分化的潛能，在牙周膜改建以及再生修復(fù)中具有非常重要的功能［1-3］。課題組前期為了探明力對(duì)牙周膜改建及修復(fù)的影響，模擬咬合力對(duì)體外培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞加載力學(xué)刺激，發(fā)現(xiàn)PDLSCs 中可表達(dá)一種促組織再生修復(fù)的力生長因子（mechano growth factor，MGF）［4］。

由于MGF 與力學(xué)刺激關(guān)系密切，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MGF 作用下PDLSCs 中的力敏感蛋白Yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）357 位酪氨酸位點(diǎn)磷酸化水平顯著升高。研究發(fā)現(xiàn)，YAP 蛋白是一種力學(xué)刺激敏感蛋白，廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄共激活因子［5］。且YAP 為轉(zhuǎn)錄輔助因子，并不直接結(jié)合DNA 發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，而主要是依賴DNA 結(jié)合因子執(zhí)行調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的功能。YAP 蛋白最早在果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，具有高度保守性，在胚胎的發(fā)生發(fā)育、干細(xì)胞的自我更新以及組織的再生修復(fù)中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用［6］。而MGF 作為一種與力相關(guān)的生化因子，可以激活力敏感蛋白YAP，其作用和分子機(jī)制值得進(jìn)一步的探討。本研究采用人工合成的MGF 功能肽段，MGF-Ct24E 肽作用于體外培養(yǎng)的PDLSCs，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖分化的影響，并以YAP 為關(guān)鍵分子，探討MGF 作用下細(xì)胞響應(yīng)的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

胎牛血清（四季青公司，中國）；MGF E 肽（Phoenix 公司，美國）；ɑ-MEM 培養(yǎng)基（gibco 公司，美國）；小鼠抗人STRO-1 單克隆抗體（Biolegend 公司，美國）；抗小鼠IgM 免疫磁珠（MiltenyiBiotec 公司，德國）；PE 標(biāo)記抗人CD29、CD90、CD105、CD34和CD45 抗體（Biolegend 公司，美國）；成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液、茜素紅染液、油紅O 染液（Cyagen 公司，美國）；CCK8 檢測(cè)試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（新賽美公司，中國）；兔抗人PCNA、Scleraxis、Osterix 蛋白單克隆抗體（Abcam 公司，英國）；兔抗人YAP、P-YAPY357蛋白單克隆抗體（CST 公司，美國）；小鼠抗人GAPDH 蛋白單克隆抗體、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒、DAPI 染液（壯志公司，中國）。

1.2 PDLSCs 的分離培養(yǎng)、分選與鑒定

取得患者知情同意，收集患者因正畸拔除的健康無齲第一前磨牙，選取患者年齡集中在18 ～30 歲之間，采用酶消組織塊法獲得原代細(xì)胞。該研究已獲得空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)的倫理豁免。第一次更換培養(yǎng)液為培養(yǎng)后7 d，進(jìn)行半量更換，隨后3 ～4 d 換液1 次，當(dāng)細(xì)胞生長融合度達(dá)到80%時(shí)，以1∶3 ～1∶4 的比例進(jìn)行傳代。定期在光鏡下觀察并進(jìn)行拍照。

取P2 代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，采用免疫磁珠法分選獲得STRO-1/MACS（+）細(xì)胞，方法簡(jiǎn)述如下：胰酶消化后，制備單細(xì)胞懸液，加入小鼠抗人STRO-1 抗體（1∶50）進(jìn)行孵育，隨后采用抗小鼠IgM 免疫磁珠孵育后，細(xì)胞于免疫磁珠分選裝置中分選。將分選的STRO-1 陽性細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞生長融合度達(dá)到80%時(shí)，以1∶3 ～1∶4 的比例進(jìn)行傳代。

1.2.1 細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定 取生長狀態(tài)良好的STRO-1/MACS（+）細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL。將細(xì)胞分裝至無菌EP 管中，每管200 μL，共6 管，分別加入PE 標(biāo)記的細(xì)胞表面標(biāo)記物抗體CD34、CD45、CD29、CD90 和CD105，充分混勻后置于4 ℃條件下避光孵育1 h。隨后800 rpm離心5 min，棄去上清，加入200 μL 無菌PBS 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸清洗，該過程重復(fù)2次。最后加入200 μL無菌PBS 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸，采用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)進(jìn)行分析。

1.2.2 克隆形成能力鑒定 取生長狀態(tài)良好的STRO-1/MACS（+）細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×103個(gè)/mL。向培養(yǎng)皿中加入100 μL 細(xì)胞懸液，每3 d 更換一次培養(yǎng)液，14 d 后終止培養(yǎng)。4%多聚甲醛室溫固定30 min 后，加入0.1%結(jié)晶紫的PBS 室溫染色15 min。PBS 沖洗并置于大體下及光鏡下觀察并拍照。選取含有50 個(gè)以上的細(xì)胞組成的團(tuán)塊為一個(gè)細(xì)胞克隆，計(jì)算克隆形成率。克隆形成率=細(xì)胞克隆數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.3 多向分化能力鑒定 取生長狀態(tài)良好的STRO-1/MACS（+）細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL。將細(xì)胞接種于6 孔板中，置于孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長融合至80%時(shí)，更換成骨誘導(dǎo)液及和成脂誘導(dǎo)液，成骨誘導(dǎo)21 d 后進(jìn)行茜素紅染色；成脂誘導(dǎo)14 d 后進(jìn)行油紅O 染色。

1.2.4 生長曲線 取生長狀態(tài)良好的STRO-1/MACS（+）細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL。將細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL。共設(shè)計(jì)9 組，每組6 個(gè)復(fù)孔，分別于接種后0～8 d采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性。0 d為接種后12 h 進(jìn)行檢測(cè)，每孔加入CCK8 溶液10 μL，置于孵箱中培養(yǎng)1 h，隨后采用酶標(biāo)儀于450 nm 波長處檢測(cè)各孔吸光度值（即OD 值），并取平均值。隨后每天均于該時(shí)間點(diǎn)采用同樣方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行CCK8 檢測(cè)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3 CCK8 檢測(cè)MGF-Ct24E 肽作用下PDLSCs 細(xì)胞增殖活性的變化

取生長狀態(tài)良好的PDLSCs，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL。將細(xì)胞接種于96 孔板中，孵箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h 進(jìn)行同步化處理。為檢測(cè)MGF 對(duì)PDLSCs 細(xì)胞增殖活性的影響，細(xì)胞進(jìn)行分組處理：對(duì)照組、10 ng/mL MGF 組、50 ng/mL MGF 組和100 ng/mL MGF 組，每組設(shè)置6 個(gè)重復(fù)樣本。按實(shí)驗(yàn)分組更換含有不同濃度MGF-Ct24E 肽的無血清培養(yǎng)液，置于孵箱中培養(yǎng)24 h。隨后加入CCK8 溶液每孔10 μL，置于孵箱中培養(yǎng)1 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm 波長處檢測(cè)各孔吸光度值。

1.4 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中PCNA、Scleraxis、Osterix、YAP、P-YAPY357蛋白表達(dá)

取生長狀態(tài)良好的PDLSCs，胰酶消化，完成后加入2 mL 完全培養(yǎng)基終止消化，800 rpm 離心5 min，棄去上清并重懸細(xì)胞。將細(xì)胞以1×106個(gè)/mL接種于12 孔板。共設(shè)計(jì)4 組：對(duì)照組、10 ng/mL MGF 組、50 ng/mL MGF 組和100 ng/mL MGF 組。

待細(xì)胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h進(jìn)行同步化處理，隨后按設(shè)計(jì)分組更換含有不同濃度MGF E 肽的無血清培養(yǎng)液，置于孵箱中培養(yǎng)24 h 后提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度后，加入Loading Buffer 煮沸10 min，-80 ℃保存。取等量總蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，將膜置于對(duì)應(yīng)一抗中，4 ℃孵育過夜，次日孵育二抗，室溫震蕩孵育2 h。用條帶蘸取發(fā)光液，進(jìn)行顯影成像，采用ImageJ 軟件進(jìn)行蛋白條帶吸光度進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.5 免疫熒光檢測(cè)MGF-Ct24E 肽作用下PDLSCs中YAP 的核定位

取生長狀態(tài)良好的PDLSCs，胰酶消化，完成后加入2 mL 完全培養(yǎng)基終止消化，800 rpm 離心5 min，棄去上清并重懸細(xì)胞。將細(xì)胞以1×104個(gè)/mL接種于24 孔板。共設(shè)計(jì)2 組：對(duì)照組和50 ng/mL MGF 組。

待細(xì)胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h 進(jìn)行同步化處理，隨后按設(shè)計(jì)分組更換含有不同濃度MGF-Ct24E 肽的無血清培養(yǎng)液，置于孵箱中培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)液、4% 多聚甲醛室溫固定1 h，隨后棄去固定液，加入封閉液室溫封閉20 min，棄去封閉液，加入一抗，4 ℃孵育過夜，次日采用PBST 以1∶500 稀釋熒光二抗，室溫避光孵育2 h，棄去二抗，隨后加入DAPI 工作液，室溫避光孵育15 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 siRNA 干 擾YAP 的 蛋 白 表 達(dá)

選取生長狀態(tài)良好的PDLSCs，分為control 組、siRNA-NC 組、YAP siRNA 1 組、YAP siRNA 2 組、YAP siRNA 3 組，其中未轉(zhuǎn)染細(xì)胞僅加入轉(zhuǎn)染試劑，而轉(zhuǎn)染細(xì)胞干擾序列如下：siRNA-NC F: UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，R: ACGUGACACGUU CGGAGAATT；YAP siRNA 1 F: GACCAAUAGCUCA GAUCCUUUTT，R: AAAGGAUCUGAGCUAUUGGUCTT；YAP siRNA 2 F: CAGGUGAUACUAUCAACCA AATT，R: UUUGGUUGAUAGUAUCACCUGTT；YAP siRNA 3 F: GCCACCAAGCUAGAUAAAGAATT，R:UUCUUUAUCUAGCUUGGUGGCTT，轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine 2000 說明書。轉(zhuǎn)染48 h 后，采用Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中YAP 的蛋白水平。選取干擾效率高的siRNA 干擾YAP 的表達(dá)后，采用MGFCt24E 肽作用PDLSCs，Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中PCNA、Scleraxis 和COL1A1 的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組的比較；采用單因素方差分析進(jìn)行多個(gè)處理組的比較，兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PDLSCs 的分離培養(yǎng)、分選與干細(xì)胞鑒定

采用酶消組織塊法對(duì)牙周膜細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，2 周后可見梭形細(xì)胞從組織塊周圍爬出，細(xì)胞迅速增殖，圍繞組織塊呈放射狀排列，培養(yǎng)4 周后可見細(xì)胞圍繞組織塊大量增殖（圖1a、1b）。細(xì)胞傳代后，可見大量梭形細(xì)胞。采用免疫磁珠法對(duì)傳代獲得的P2 代細(xì)胞進(jìn)行磁珠分選后，得到大小、形狀均一的梭形細(xì)胞（圖1c），陽性細(xì)胞數(shù)目為細(xì)胞總量的1% ～2%。

對(duì)細(xì)胞生長曲線進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長曲線呈“S”形，并且細(xì)胞于接種后3 d 開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，而到6 d 后，細(xì)胞生長速度明顯降低，進(jìn)入了平臺(tái)期（圖1d）；細(xì)胞多向分化能力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過成骨誘導(dǎo)21 d 后，茜素紅染色可見紅色鈣結(jié)節(jié)出現(xiàn)；經(jīng)過成脂誘導(dǎo)21 d 后，油紅O 染色可見紅色脂滴出現(xiàn)（圖1e、1f）；細(xì)胞克隆形成能力分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過結(jié)晶紫染色后，可見大量集落樣生長的細(xì)胞，呈明顯的細(xì)胞團(tuán)塊狀聚集在一起，經(jīng)過計(jì)數(shù)，其克隆形成率約為（46 ± 4.8）%（圖1g、1h）。

采用流式儀對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞的CD29 表達(dá)量為99.8%、CD90 表達(dá)量為99.8%、CD105 表達(dá)量為97.8%、CD34 表達(dá)量為1.7%、CD45 表達(dá)量為1.4%，以上結(jié)果說明經(jīng)過免疫磁珠分選得到的STRO-1/MACS（+）細(xì)胞可高表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，低表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志物，具有干細(xì)胞特性（圖1i ～1n）。

2.2 MGF-Ct24E 肽作用下PDLSCs 增殖能力增強(qiáng)

當(dāng)不同濃度MGF 作用于PDLSCs 后，采用CCK8 法對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MGF 濃度為50 ng/mL，100 ng/mL，作用24 h 后，細(xì)胞活性明顯上調(diào)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.67，P＜0.05）（圖2a）；采用Western blot 對(duì)細(xì)胞PCNA 蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MGF 濃度為50 ng/mL、100 ng/mL，作用24 h 后，細(xì)胞PCNA 蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 12.48，P＜0.05）（圖2b、2c）。提示當(dāng)MGF 濃度為50 ng/mL 時(shí)，能夠明顯提高PDLSCs 的增殖能力。

圖2 MGF 對(duì)PDLSCs 增殖活性的影響Figure 2 MGF regulated the proliferation of PDLSCs

2.3 MGF-Ct24E 肽作用下PDLSCs 成纖維分化能力增強(qiáng)、成骨分化能力減弱

當(dāng)不同濃度MGF 作用于PDLSCs 后，采用Western blot 對(duì)細(xì)胞Scleraxis、Osterix、COL1A1 蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)（圖3a），當(dāng)MGF 濃度為50 ng/mL，100 ng/mL，作用24 h 后，細(xì)胞Scleraxis、COL1A1 蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 35.36，F(xiàn)= 6.73，P＜0.05）（圖3b、3c）；此外，MGF 在各個(gè)濃度下，作用24 h 后，細(xì)胞的Osterix 蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 40.91，P＜0.01）（圖3d）。提示當(dāng)MGF 濃度為50 ng/mL，100 ng/mL 時(shí)，能夠明顯提高PDLSCs 的成纖維分化能力；同時(shí)，MGF 在各個(gè)濃度下，均能明顯降低PDLSCs 的成骨分化能力。

圖3 MGF 對(duì)PDLSCs 分化的影響Figure 3 MGF regulated the differentiation of PDLSCs

2.4 MGF-Ct24E 肽作用下PDLSCs 中YAP 蛋白磷酸化程度增強(qiáng)，并聚集于細(xì)胞核

當(dāng)50 ng/mL 的MGF 作 用 于PDLSCs 后，采 用Western blot 對(duì) 細(xì) 胞P-YAPY357、YAP 蛋 白 表 達(dá) 量 進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞P-YAPY357/YAP 相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.63，P＜0.05）（圖4a、4b）；采用免疫熒光染色對(duì)細(xì)胞YAP 蛋白定位情況進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，YAP 蛋白定位于細(xì)胞核，呈現(xiàn)明顯的核聚集情況，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 3.92，P＜0.01）（圖4c、4d）。

圖4 MGF 激活PDLSCs 中YAP 蛋 白Figure 4 MGF activated YAP protein in PDLSCs

2.5 抑制YAP 表達(dá)后對(duì)MGF-Ct24E 作用下PDLSCs細(xì)胞增殖及分化的影響

研究發(fā)現(xiàn)，YAP siRNA 1 組篩選效果最佳，采用YAP siRNA 1 組抑制YAP 表達(dá)后，MGF-Ct24E 作用下PDLSCs 細(xì)胞增殖標(biāo)志蛋白PCNA（F= 11.59，P＜0.01）以及細(xì)胞成纖維分化標(biāo)志蛋白Scleraxis（F= 77.25，P＜0.01）和COL1A1（F= 24.27，P＜0.01）的表達(dá)顯著下調(diào)（圖5a、5b）。

圖5 干擾YAP 蛋白后可抑制MGF 促PDLSCs 增殖分化作用Figure 5 Interference with the YAP protein inhibited the proliferation and differentiation of PDLSCs induced by MGF

3 討 論

牙周膜是保證牙齒穩(wěn)固，維持正?？陬M系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的重要結(jié)構(gòu)［7-8］。但疾病、外傷等因素可能造成牙周膜組織損傷，且損傷后難以再生修復(fù)，最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)甚至造成牙齒脫落［9］。課題組前期研究根據(jù)力可調(diào)控牙周膜改建這一特征，體外模擬咬合力后作用牙周膜細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，力刺激下牙周膜細(xì)胞中可表達(dá)促組織再生修復(fù)的力生長因子MGF。為探明MGF 在牙周組織中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用其功能肽段，MGF-Ct24E 肽作用于體外培養(yǎng)的PDLSCs，MGF-Ct24E 肽可促進(jìn)PDLSCs 增殖并向牙周膜成纖維細(xì)胞分化。以上結(jié)果提示，MGF 具有促進(jìn)牙周膜組織再生修復(fù)的功能。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，MGF-Ct24E 肽可激活力敏感蛋白YAP 信號(hào)通路，并通過YAP 調(diào)控PDLSCs 增殖分化。

MGF 是力學(xué)刺激作用下胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）基因選擇性剪接產(chǎn)生的變異體，是力學(xué)刺激激活細(xì)胞核內(nèi)的剪切因子產(chǎn)生的［10］。MGF 作為力相關(guān)細(xì)胞因子，最早是由Yang 等［10］在1996 年對(duì)肌肉組織中的IGF-1 進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的，MGF 作為IGF-1 的剪接變異體，其特征之一就是隨著力學(xué)刺激而迅速產(chǎn)生，而當(dāng)在不受力的情況下，MGF 的表達(dá)量則比較低。MGF 在體內(nèi)的分布十分廣泛，可在肌肉、神經(jīng)、骨和軟骨等組織中表達(dá)，并具有促進(jìn)組織再生修復(fù)的功能［11-13］。且MGF 調(diào)控的組織多集中在與力學(xué)刺激相關(guān)的肌骨系統(tǒng)中，如肌肉、骨、韌帶及軟骨等組織中。在肌肉組織損傷修復(fù)中，MGF-Ct24E 具有促進(jìn)肌干細(xì)胞增殖的作用。研究發(fā)現(xiàn)，MGFCt24E 可改善小鼠肌營養(yǎng)不良等癥狀［14］。此外，在骨、軟骨再生過程中，MGF-Ct24E 可促進(jìn)成骨、成軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成［15］。值得注意的是，在肌腱韌帶組織的再生修復(fù)中，MGF-Ct24E 可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，并促進(jìn)膠原的合成［16］。本研究同樣證實(shí)了MGF-Ct24E 可提高PDLSCs 的增殖活性，并促進(jìn)細(xì)胞中COL1A1 膠原的合成。另一方面大量研究發(fā)現(xiàn)MGF-Ct24E 具有促進(jìn)細(xì)胞分化的功能，且根據(jù)環(huán)境不同分化方向也不同。本研究發(fā)現(xiàn)，MGF-Ct24E 可促進(jìn)細(xì)胞向成纖維分化，提示MGF 可能會(huì)通過這種方式促進(jìn)牙周膜損傷的再生修復(fù)。

大量研究關(guān)注了MGF 調(diào)控的相關(guān)信號(hào)通路蛋白，MGF 雖然是IGF-1 的剪接變異體，但該蛋白功能的發(fā)揮并不是通過與IGF-1R 結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。目前研究發(fā)現(xiàn)，MGF 主要可通過絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT 及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，MGF-Ct24E 可激活力敏感蛋白YAP 蛋白Y357 位點(diǎn)發(fā)生磷酸化修飾，并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，而抑制YAP 的活性則可對(duì)細(xì)胞增殖分化造成影響。大量研究發(fā)現(xiàn)，YAP 蛋白的胞內(nèi)定位通常與細(xì)胞的增殖及分化調(diào)控有關(guān)，當(dāng)細(xì)胞增殖活躍時(shí)，YAP 蛋白定位于胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子TEAD 結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮其下游調(diào)控功能；當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，YAP 蛋白定位于胞質(zhì)中，并進(jìn)一步被降解［18］。同時(shí)，YAP 作為為轉(zhuǎn)錄輔助因子，可與DNA結(jié)合因子執(zhí)行調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的功能，并調(diào)控細(xì)胞分化。除本研究之外，Jing 等［15］研究同樣發(fā)現(xiàn)，MGF 通過RhoA 信號(hào)通路調(diào)控YAP 的活化以及核轉(zhuǎn)位，影響細(xì)胞遷移。作為力敏感蛋白，MGF 對(duì)其激活是否可與力激活形成疊加，促進(jìn)組織再生修復(fù)，仍值得進(jìn)一步探討。

綜上所述，筆者研究發(fā)現(xiàn)MGF 通過激活YAP蛋白的活性，促進(jìn)PDLSCs 增殖及成纖維分化。本研究為后續(xù)進(jìn)一步探究MGF 調(diào)控牙周膜再生修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為臨床中治療牙周膜缺損提供新的策略。

【Author contributions】Tu T and Zhao Y wrote the article. Liu YL,Wang H, Zhang M revised the article. Zhang M designed the study. All authors read and approved the final manuscript as submitted.