楊靖雯， 周海文

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔黏膜病科，上海交通大學口腔醫(yī)學院，國家口腔醫(yī)學中心，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，上海市口腔醫(yī)學重點實驗室，上海市口腔醫(yī)學研究所，上海（200011）

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種新型非編碼RNA，1976 年circRNA 在植物病毒中被首次發(fā)現，描述為“共價閉合的單鏈環(huán)狀RNA 分子”，起初被認為是RNA 異常剪接的副產物［1］。隨著RNA測序技術和生物信息學的發(fā)展，研究發(fā)現circRNA在生物的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用：miRNA 海綿功能、調節(jié)可變剪接以及調節(jié)基因表達［2］?，F已發(fā)現circRNA 在癌癥的發(fā)生、發(fā)展和耐藥性中起著至關重要的作用，且circRNA 在外泌體和人體體液中含量豐富，可通過細胞間通訊對腫瘤微環(huán)境產生影響［3］。circRNA 主要由外顯子環(huán)化形成，廣泛穩(wěn)定存在于生物體內，在基因表達調控中發(fā)揮重要作用，可作為疾病的生物標志物，在臨床診斷和治療方面有廣闊的應用前景。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾是發(fā)生在堿基腺嘌呤（A）第六位N 原子上的甲基化，主要發(fā)生在RRACH 序列中的A 上。近年研究發(fā)現，m6A 甲基化修飾circRNA 在人胚胎干細胞中顯示出特異性甲基化模式，m6A 修飾可促進circRNA 降解、核輸出，并對circRNA 翻譯有調控作用［4］。本文就circRNA m6A 甲基化修飾在機體生理過程、惡性腫瘤及口腔疾病中的研究現狀作一綜述。

1 m6A 修飾概述

m6A 甲基化修飾是一個動態(tài)且可逆的過程，這種修飾由3 種調節(jié)蛋白控制，分別是甲基轉移酶、去甲基化酶和閱讀蛋白。①甲基轉移酶促使RNA m6A 甲基化，甲基轉移酶樣蛋白3/14（methyltransferase-like 3/14，METTL3/14）可形成復合物使RNA m6A 甲 基 化，Wilmstunwell binding 蛋 白 輔 助METTL3/14 定位并維持體內m6A 甲基轉移酶的催化活性［5］，此外，RNA 結合基序蛋白15/15B（RNAbindingmotifprotein 15/15B，RBM15/15B）和類病毒m6A 甲基轉移酶（vir-like m6A methyltransferase associated，VIRMA）在調節(jié)METTL3 和METTL14 活動中發(fā)揮重要作用［6］；②去甲基化酶執(zhí)行RNA 去甲基化功能，肥胖相關蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）和alkB 同 源 物5（demethylated by human AlkB homolog H5，ALKBH5）一起維持轉錄組中m6A 水平的平衡［7-8］；③閱讀蛋白可識別m6A 位點并結合甲基化RNA，其中最突出的是含有YTH 結構域的RNA 結合蛋白，在細胞質中特異性識別m6A 修飾的mRNA，能與m6A RRACH 片段重疊以介導RNA 特異性結合［9］，此外，閱讀蛋白還包括異質核核糖核蛋白（eterogeneous nuclear ribonucleoproteins，HNRNP）家族（HNRNPC/HNRNPG/HNRNPL/HNRNPA2B1）［10］、胰島素樣生長因子2 結合蛋白家族（insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins，IGF2BP1/2/3）及PRRC2A。

2 m6A 修飾對circRNA 的調控作用

2.1 m6A 修飾調節(jié)circRNA 翻譯

Yang 等［11］發(fā)現m6A 基序通過募集YTH m6A RNA 結合蛋白1（YTH m6A RNA binding protein 1，YTHDF1）和翻譯起始因子eIF4G2/eIF3A 啟動并誘導circRNA 翻譯，且數百種的內源性circRNA 具有翻譯潛力。近期研究表明，m6A 修飾可通過YTHDF3 和eIF4G2 的識別調節(jié)circRNA 翻譯［12］。

2.2 m6A 修飾促進circRNA 的核輸出

Chen 等［13］首次發(fā)現m6A 修飾會促進circRNA的核輸出：YTHDC1 可與源自NOP2/Sun 結構域家族成員2（NOP2/Sun domain family member 2，NSUN2）的circNSUN2 結合，促進circNSUN2 以m6A 依賴性方式從細胞核輸出到細胞質。此外有研究發(fā)現，Hel25E 的同源蛋白UAP56 和URH49 可介導不同長度的circRNA 的出核，然而兩者對circRNA 長度測量的詳細機制仍不清楚［14］。

2.3 m6A 修 飾 促 進circRNA 降 解

由于封閉的環(huán)狀結構，circRNA 不易被水解，往往比其親本線性RNA 更穩(wěn)定。m6A 甲基化修飾的circRNA 依賴熱反應蛋白-12（heat-responsive protein 12，HRSP12）與YTHDF2 結合，通過核糖核酸內切酶切割選擇性降解circRNA［15］。

3 circRNA m6A 甲基化修飾在機體生理過程中的作用

3.1 免疫系統(tǒng)

研究表明m6A 甲基化修飾可調控免疫反應，circRNA 為封閉的環(huán)狀結構，能逃離末端監(jiān)控系統(tǒng)。研究發(fā)現，機體通過YTHDF2 識別m6A 以辨認“自身”circRNA，抑制RIG-I 激活從而抑制先天免 疫［16］。 此 外，源 自NDUFB2 的circNDUFB2（hsa_circ_0007518）可觸發(fā)非小細胞肺癌細胞的免疫防御反應，通過RIG-I 識別以激活RIG-I-MAVS信號級聯(lián)，將免疫細胞募集到腫瘤微環(huán)境中［17］。

3.2 生殖系統(tǒng)

在雌性生殖系統(tǒng)中，METTL14 介導的m6A 甲基化修飾改變了circGFRα1 向細胞質的輸出，circ-GFRα1 通過充當競爭性內源性RNA 促進雌性生殖系干細胞自我更新，吸附miR-449，增強GFRα1表達和激活膠質細胞衍生神經營養(yǎng)因子信號通路［18］。另有研究發(fā)現，在雄性生殖細胞中，ALKBH5 和METTL3 通過調節(jié)m6A 水平影響circRNA生物合成，circRNA 在減數分裂晚期和早期單倍體雄性生殖細胞中積累并發(fā)揮作用，持續(xù)供應對晚期精子發(fā)生和正常精子功能至關重要的蛋白質［19］。

3.3 肌細胞

隨著成肌細胞發(fā)育分化，eIF4G2 和m6A 閱讀蛋白YTHDF3 的mRNA 相對表達水平增加，m6A 可驅動circRNA 翻譯，并預測骨骼肌C2C12 成肌細胞分化過程中差異表達的circRNA 的功能和編碼潛力［20］。在高糖處理的血管平滑肌細胞中發(fā)現circYTHDC2 的穩(wěn)定受YTHDC2 介導的m6A 修飾正向調節(jié)，而circYTHDC2上調可由血管平滑肌細胞中的高葡萄糖刺激誘導，敲除circYTHDC2 可抑制血管平滑肌細胞的增殖和侵襲并阻止細胞周期進程［21］。

4 circRNA m6A 甲基化修飾在惡性腫瘤中的作用

此前，m6A 甲基化修飾的研究僅局限于mRNA水平，直至2017 年Yang 等［11］報道了由m6A 甲基化驅動的廣泛翻譯，首次探索了m6A 修飾對circRNA的調控作用，為circRNA 水平的m6A 修飾研究開啟了新篇章。該研究發(fā)現circRNA 含有大量共有m6A 基序，且在翻譯起始因子eIF4G2 和m6A 閱讀蛋白YTHDF3 介導單個m6A 位點驅動翻譯起始，并被甲基轉移酶METTL3/14 增強，被去甲基酶FTO 抑制。研究發(fā)現circRNA m6A 修飾在結直腸癌［22］和肝癌［23］發(fā)生發(fā)展中也具有重要調控作用，m6A 修飾誘導circ1662 剪接與表達可加速YES 關聯(lián)蛋白1 重組蛋白核轉運，從而促進結直腸癌細胞侵襲和遷移；hsa_circ_0007456 通過與hsa-miR-139-5p 結合促進YTHDF1 表達，從而促進HCC 細胞增殖。值得注意的是，Chen 等［13］在結直腸癌肝轉移中發(fā)現了m6A 甲基化可促進circRNA 的核輸出，circNSUN2 通過YTHDC1 與IGF2BP2 從細胞核輸出到細胞質，增強下游靶基因HMGA2 的mRNA 穩(wěn)定性，促進結直腸癌細胞侵襲性，此研究結果為結直腸癌提供了一個潛在的治療靶點circNSUN2。近年來研究發(fā)現circRNA m6A 修飾還在宮頸癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、下咽鱗癌、肺動脈高壓和胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生和進展中發(fā)揮重要調控作用［24］。

5 circRNA m6A 甲基化修飾在口腔領域的研究現狀

目前，circRNA 水平的m6A 甲基化修飾在口腔方向的文獻極少，研究僅限于在成釉細胞瘤和口腔種植骨吸收方向初步研究。Niu 等［25］首次提供了人類成釉細胞瘤的m6A 修飾表達譜全景觀，認為m6A 修飾影響長鏈非編碼RNA 和circRNA 的加工，并鑒定了具有高甲基化或低甲基化m6A 修飾的差異表達的mRNA，這可能有助于觀察m6A 介導的基因表達調控機制。在口腔種植方向，RNA 甲基化酶METTL3 作用于成骨細胞外泌體中circ_0008542 的m6A 功 能 位 點，促 進circ_0008542 與miRNA-185-5p 的競爭結合，導致靶基因RANK（receptor activator of NF-kB）的增加和破骨細胞骨吸收的啟動；而RNA 去甲基化酶ALKBH5 抑制circ_0008542 與miRNA-185-5p 的結合，從而糾正骨吸收過程，提示可使用釋放ALKBH5 的外泌體增強即刻種植體的抵抗力［26］。

此外，口腔扁平苔蘚組織異常表達的circRNAs表達譜已構建，表明circRNA 在OLP 的發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用［27］。Xu 等［28］發(fā)現circRNA 在口腔潛在惡性疾病——口腔白斑（oral leukoplakia，OLK）中發(fā)揮重要作用，構建了OLK circRNA 表達譜并對OLK 中的差異circRNA 進行了全面的生物信息學分析，源于人白細胞抗原-C（human leukocyte antigen-C，HLA-C）的circHLA-C 是一種很有前景的診斷生物標志物，具有作為OLK 治療性遺傳靶點的潛力；Hsa_circ_0060927 可作為潛在的關鍵ceRNA，通過上調三結構域蛋白14（tripartite motifcontaining 14，TRIM14）海綿下游miR-195-5p 并促進OLK 癌變，Hsa_circ_0060927 有望成為通過hsa_circ_0060927/miR-195-5p/TRIM14 軸預防和治療OLK 致癌的分子標志物［29］。但circRNA 水平的m6A 甲基化修飾在口腔惡性及潛在惡性疾病方向的研究仍較少。

m6A 修飾與OSCC 的發(fā)生發(fā)展密切相關，其中研究最多的是m6A 甲基轉移酶METTL3 與METTL14 在OSCC 中的作用，但關于circRNA 的m6A 修飾在OSCC 及口腔潛在惡性疾病中的研究未見報道，因此筆者僅從m6A 相關酶在OSCC 中的研究闡述m6A 甲基化修飾在OSCC 中的研究現狀。①METTL3 是調節(jié)OSCC 腫瘤發(fā)生的關鍵因素，通過YTHDF1 介導的m6A 修飾增強c-Myc 穩(wěn)定性，促進OSCC 發(fā) 生［30］；METTL3 介 導 的m6A 修 飾 促 進BMI1 mRNA 翻譯并增強OSCC 的增殖和轉移［31］；METTL3 還可通過m6A 介導閱讀蛋白IGF2BP2 結合 增 強SLC7A11 的mRNA 穩(wěn) 定 性，促 進OSCC 進展［32］；此外，當OSCC 細胞自噬被激活時，METTL14的表達上調，METTL14 的高表達可有效降低OSCC的增殖、遷移和侵襲［33］。②m6A 去甲基化酶FTO可靶向作用于OSCC 中的eIF4G1 轉錄本并調節(jié)細胞自噬和腫瘤發(fā)生；在雷帕霉素誘導的OSCC 自噬細胞中發(fā)現，敲低FTO 表達后導致eIF4G1 下調，同時促進自噬并抑制腫瘤發(fā)生［34］；FTO 在有咀嚼檳榔習慣的OSCC 患者黏膜組織和慢性檳榔堿處理的OSCC 細胞系中上調，且FTO 在OSCC 細胞中受到FOXA2 轉錄因子負調控，表明FTO 在檳榔堿誘導的OSCC 進展中發(fā)揮致癌作用［35］；③m6A 閱讀蛋白HNRNPL 可調節(jié)OSCC 組織中SRSF3 的表達和SRSF3 外顯子的可變剪接［36］，研究表明HNRNPC 可促進OSCC 的癌變，可能成為OSCC 新的生物標志物和治療靶點［37］；沉默HNRNPA2B1 可通過上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）抑制OSCC 的增殖、遷移和侵襲，HNRNPA2B1 可能具有通過LINE-1/TGF-β1/Smad2/Slug 信號通路靶向EMT 促進OSCC 癌變的潛力［38］。

6 小 結

綜上所述，circRNA m6A 修飾在多種良惡性疾病中發(fā)揮重要臨床價值，但在口腔領域僅處于初步探索階段。circRNA m6A 修飾在口腔惡性疾病和潛在惡性疾病中的作用有廣闊的研究前景，深入探索circRNA m6A 修飾在口腔疾病中的調控機制，為口腔惡性疾病及口腔潛在惡性疾病的診斷與治療提供參考。

【Author contributions】Yang JW wrote the article. Zhou HW revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.